Her presenterer vi en protokoll for å forberede og montere Caenorhabditis elegans embryoer, registrere utvikling under et 4D-mikroskop og spore cellelinje.
4D-mikroskopi er et uvurderlig verktøy for å løse opp den embryonale utviklingsprosessen hos forskjellige dyr. I løpet av de siste tiårene har Caenorhabditis elegans dukket opp som en av de beste modellene for å studere utvikling. Fra et optisk synspunkt gjør dens størrelse og gjennomsiktige kropp denne nematoden til en ideell prøve for DIC (Differential Interference Contrast eller Nomarski) mikroskopi. Denne artikkelen illustrerer en protokoll for dyrking av C. elegans nematoder, forbereder og monterer sine embryoer, utfører 4D-mikroskopi og sporing av celleavstamning. Metoden er basert på multifokale time-lapse poster av Nomarski bilder og analyse med spesifikk programvare. Denne teknikken avslører embryonal utviklingsdynamikk på cellenivå. Enhver embryonal defekt i mutanter, for eksempel problemer i spindelorientering, cellemigrasjon, apoptose eller celle skjebnespesifikasjon, kan effektivt oppdages og scores. Nesten hver eneste celle i embryoet kan følges opp til det øyeblikket embryoet begynner å bevege seg. Sporing av hele cellelinjen til et C. elegans embryo av 4D DIC mikroskopi er arbeidskrevende, men bruken av spesifikk programvare letter i stor grad denne oppgaven. I tillegg er denne teknikken lett å implementere i laboratoriet. 4D-mikroskopi er et allsidig verktøy og åpner muligheten for å utføre en enestående analyse av embryonal utvikling.
4D-mikroskopi er et multifokalt tidsforløpopptakssystem som gjør det mulig for forskere å registrere og kvantifisere celledynamikken til en biologisk prøve både romlig og over tid. Cellekulturer, gjær eller levende vev kan bli utsatt for 4D-analyse, men denne teknikken er spesielt egnet for å analysere utviklingen av levende embryoer. Oppløsningen av denne analysen når nivået på hver eneste celle i embryoet. Hver celledeling kan oppdages, og cellebevegelser kan spores over tid. Celle skjebner vurderes i henhold til posisjonen og formen som cellene får. Bruken av Nomarski-optikk forbedrer kontrasten til uoppdagede gjennomsiktige prøver ved hjelp av ortogonalt polariserte lysstråler som forstyrrer brennplanet. De resulterende bildene vises tredimensjonale, opplyst på den ene siden.
Andre metoder basert på bruk av konfektmikroskopi og GFP-transgene dyr for automatisk deteksjon av kjerner og generering av celleavstamninger er utviklet 1,2. Fordelen med disse systemene er åpenbar: programvaren overstyrer i stor grad behovet for manuell merking av hver kjerne over en periode (selv om det kreves noe manuell tilsyn i de sene stadiene). Imidlertid forblir cellulære prosesser som involverer endringer i celleform eller membrandynamikk, for eksempel de som forekommer under celledifferensiering, migrasjon, apoptose eller lik engulfment, skjult som en svart bakgrunn i de fluorescerende merkede nukleibildene.
Derimot viser 4D Nomarski mikroskopi (også kalt DIC mikroskopi, Differensial interferenskontrastmikroskopi) både nuklei- og celleformendringer som oppstår under utviklingen av ville eller mutante dyr. Dette tillater sporing av cellelinje ved hjelp av standard mikroskoper, og bruker bare overført lys. Det er ikke noe generelt behov for å bruke transgene dyr bortsett fra å vise spesifikke uttrykksmønstre, i så fall kan fluorescerende skanninger interkaleres. Derfor kan dette være den optimale tilnærmingen for mange laboratorier som arbeider med dynamiske celleprosesser som embryogenese eller apoptose som kan fremheves under DIC-mikroskopi 3,4,5,6,7.
Flere fleksible og brukervennlige programmer er tilgjengelige for å fange mikroskopiske bilder og rekonstruere celleavstamninger, 3D-modeller, cellemigreringsbaner, etc. i den innspilte prøven. I et standardeksperiment blir bilder anskaffet i en rekke fokusplan, i konstant avstand, hvorav antallet avhenger av prøvetykkelsen. Temporal oppløsning av analysen kan optimaliseres ved å øke skannefrekvensen. Det er praktisk talt ingen grense for varigheten av opptaket annet enn datamaskinens lagringskapasitet. For eksempel, for en C. elegans embryoutviklingsanalyse , kjøper vi rutinemessig bilder på 30 fokalplan (1 mikron-trinn hver), hvert 30.
Disse systemene har blitt brukt på analysen av flere animalske embryoer som Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, andre nematode embryoer12,13, tardigrader14,15 og til og med tidlige museembryoer16. Det eneste kravet er å ha et gjennomsiktig embryo i stand til å utvikle seg på glidepreparatet under mikroskopet.
Oppsummert er DIC-basert 4D-mikroskopi spesielt nyttig for 1) analyse av embryonal utvikling av små, gjennomsiktige dyr: sporing av cellelinje, cellemigrasjonsbaner, generering av 3D-modeller, etc; 2) definere genuttrykksmønstre; 3) studere cellekulturdynamikk, fra gjær til menneskelige celler; 4) analysere vevsdynamikk eller embryofragmenter; 5) kvantifisere celle død kinetikk og lik engulfment; og 6) utføre komparativ fylogeni analyse basert på embryonale utviklingsegenskaper. Hvis det er interesse for noen av disse emnene (eller lignende), kan 4D-mikroskopi brukes.
En av de største utfordringene i moderne biologi er å forstå utviklingen av multicellulære organismer. C. elegans har dukket opp som en av de best egnede modellene for å studere den fine koordineringen mellom celleproliferasjon og celledifferensiering i det utviklende embryoet. Fra et optisk synspunkt gjør den gjennomsiktige kroppen og den lille størrelsen denne nematoden til et ideelt eksemplar for DIC-mikroskopi. Andre organismer med lignende egenskaper har også blitt utsatt for 4D-mikroskopianalyse 11,12,13,14,15,16.
For disse utviklingsstudiene gir geninaktivering av enten fremover eller omvendt genetikk en anelse om dens involvering i embryogenese. Når et gen har vist seg å spille en rolle i utviklingen, er neste trinn å definere sin eksakte rolle i etableringen av riktig kroppsplan. Immunostaining er den valgte tilnærmingen for de fleste modeller. Denne teknikken belyser problemer i celledifferensiering eller uttrykk for bestemte markører. En stor begrensning av denne tilnærmingen er imidlertid at den bare gir et statisk syn på uttrykket av en enkelt eller flere markører på et fast tidspunkt i utviklingen. Et dynamisk syn på disse markørene gjennom utviklingen kan bare oppnås ved å farge forskjellige embryoer på forskjellige tidspunkter. I tillegg er cellelinjerekonstruksjon ikke mulig i slike faste prøver.
4D-mikroskopi er en komplementær tilnærming for å studere embryonal utvikling. Denne teknikken viser utviklingsdynamikk ved en cellenivåoppløsning. Enhver feil i embryoet som problemer i spindelorientering, cellemigrasjon, apoptose, celle skjebne spesifikasjon, etc. vil dukke opp i en 4D-film som kan visualiseres fremover og bakover, kvantifisert og scoret av forskeren. Ved hjelp av denne teknikken kan nesten hver celle i embryoet følges opp til det øyeblikket embryoet begynner å bevege seg. Embryoer utsatt for 4D-mikroskopi med bare synlig lys og Nomarski-optikk pådrar seg ikke fotodamage. Fluorescerende skanninger kan også interkaleres i opptaket for å oppdage når og hvor et gen uttrykkes. Embryoer som lider av betydelig fotodamage identifiseres av cellesyklusutvidelsen som forårsaker sterk UV-bestråling sammenlignet med et standard WT-avstamningsembryo. I så fall kan fotodamage reduseres ved å senke UV-lampeintensiteten og øke kameraets følsomhet eller eksponeringstid. Morfologiske egenskaper og molekylære markører kan bidra til å avklare embryonal utvikling av mutant.
Å sette opp et 4D-mikroskopisystem er enkelt å implementere i laboratoriet, og etter en viss praksis muliggjør en uovertruffen analyse av celledynamikk og avstamningssporing av cellekulturer og levende gjennomsiktige prøver på et oppløsningsnivå av hver celle i mikroskopfeltet. Sporing av cellelinje på DIC-bilder behandles fortsatt for hånd. Det er tidkrevende, og selv om programvaren oppdager avledningsfeil som forskjellige avgrener som markerer samme celle, er feil mulig. Mens automatisk deteksjon av GFP-merkede celler er godt utviklet2, er komplementær linjesporingsprogramvare basert på umerkede celler og synlige lysbilder fortsatt i tidlig fase og ikke veldig nyttig for en full embryoanalyse. Uten tvil vil bruk av bildegjenkjenningssystemer til feltet synlig lysmikroskopi føre til et stort fremskritt på dette feltet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) og den spanske ministeren de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda er finansiert av et fellesskap fra AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).
Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |