Summary

Transuterin fetal trakeal ocklusion modell hos möss

Published: February 05, 2021
doi:

Summary

Olika djurmodeller av medfödda diaphragmatic bråck och fetala trakeal ocklusion presenterar fördelar och nackdelar när det gäller etiska frågor, kostnad, kirurgisk svårighet, storlek, överlevnad och tillgång till genetiska verktyg. Denna modell ger ett nytt verktyg för att studera effekten av både trakeal ocklusion och ökat luminalt tryck på lungutvecklingen.

Abstract

Fetala trakeal ocklusion (TO), en etablerad behandling modalitet, främjar fetala lung tillväxt och överlevnad i allvarliga medfödda diaphragmatic bråck (CDH). Efter TO ökar retentionen av den utsöndrade epitelvätskan luminaltrycket och inducerar lungtillväxt. Olika djurmodeller har definierats för att förstå patofysiologin hos CDH och TO. Alla har sina egna fördelar och nackdelar som teknikens svårighetsgrad, djurets storlek, kostnad, hög dödlighet och tillgången på genetiska verktyg. Häri beskrivs en ny transuterin modell av murin fetala TO. Gravida möss bedövades, och livmodern exponeras via en midline laparotomy. Luftstrupen hos utvalda foster var ligated med en enda transuterin sutur placeras bakom luftstrupen, en halsartären och en halsven. Dammen stängdes och fick återhämta sig. Foster samlades in strax före förlossningen. Lung-till-kroppsvikt förhållandet i TO foster var högre än det i kontroll foster. Denna modell ger forskare ett nytt verktyg för att studera effekten av både TO och ökat luminalt tryck på lungutvecklingen.

Introduction

Medfödda diaphragmatic bråck (CDH) förekommer i 1:2500 graviditeter och resulterar i pulmonell hypoplasi och neonatal pulmonell hypertoni1,2,3,4,5,6. Fetala trakeal ocklusion (TO) är en etablerad prenatala terapi i allvarliga CDH patienter omfattar fetoskopi i 26-30th graviditetslängd veckan där en ballong placeras strax ovanför carina och sedan tas bort i den 32: a graviditetslängd veckan. Denna tillfälliga TO inducerar fetala lungtillväxt och förbättrar överlevnaden. Medfödda High Airway Obstruction Syndrome är ett dödligt tillstånd i samband med lunghyperplasi, som inspirerade kirurger att utföra konstgjord ocklusion av luftstrupen för att främja retention av den utsöndrade epitelvätskan. Denna ocklusion ökade luminal tryck och inducerad lungtillväxt7. Ocklusion bör dock vändas för att möjliggöra epitelcellsmognad.

Olika djurmodeller av CDH och TO – får, kanin, råtta och mus – har utvecklats för att förstå patofysiologin hos CDH och TO. Alla har sina egna fördelar och nackdelar som teknikens svårighetsgrad, djurets storlek, kostnad, hög dödlighet och tillgången på genetiska verktyg. Även om den kirurgiska tekniken som används för fårmodellen är mycket lik den som används hos människor och kan vändas, är de stora nackdelarna med denna modell kostnaden för djuret, den långa graviditetsperioden och det begränsade antalet operationer som är möjliga. Kaninmodellen har en kortare graviditetsperiod och är billigare än fårmodellen. Kaninmodellen är dock oåterkallelig8,9. Murinmodellen har den lägsta kostnaden, det högsta antalet foster som genomser graviditet, det bäst karakteriserade genomet och allmänt tillgängliga verktyg för cellulära och molekylära analyser. En viktig nackdel är dock bristen på reversibilitet hos TO, vilket förhindrar full förståelse för effekterna av TO. Häri presenteras en metod som kombinerar alla fördelar med de tidigare nämnda modellerna och skapar en enkel, potentiellt reversibel och minimalt invasiv gnagare TO-modell.

Protocol

Alla försök har följt De nationella hälsoinstituten för vård och användning av laboratoriedjur (NIH Publications Nr. 80023, reviderad 1978). Förfarandet godkändes med IACUC-protokoll #2016-0068 av Cincinnati Children’s Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Förberedelse För att para åldersmatchade vilda (WT) C57BL/6 möss, placera dem i samma bur klockan 18:00.m. och separera dem klockan 9:00.m. nästa dag. För att bestämma embryon…

Representative Results

I denna studie undersöktes 37 foster: 20 (54,1 %) jämfört med 17 (45,9 %) som kontroll. Eftersom luftstrupen inte kunde ocklusuderas i 4 foster i TO-gruppen uteslöts de från studien. Det fanns ingen signifikant skillnad i dödlighet i båda grupperna: 4 foster (25%) i TO-gruppen och 2 foster (12%) i kontrollgruppen (p=0,334, oddskvot (OR) 2,5, 95% konfidensintervall (CI) 0,39-16,05). Medelvikten, lungvikten och förhållandet mellan lungvikt och kroppsvikt (LBWR) var högre i TO-grup…

Discussion

Denna metod beskriver ett kirurgiskt ingrepp av fetala trakeal ocklusion hos möss och dess inverkan på lung utveckling. Det finns några kritiska steg i protokollet som bör utföras noggrant för framgångsrik TO. Värmen i plattformen där operationen äger rum och saltlösningen som införs i bukhhålan är avgörande för graviditetens utveckling. Dessutom måste ett litet tryck appliceras på valparna för att säkerställa exponering av nacken.

En 6,0 polypropylen sutur är den enda su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning fick inget särskilt bidrag från finansiärer inom den offentliga, kommersiella eller ideella sektorn. Alla författare har lämnat betydande bidrag till utformningen och utformningen av studien, förvärv, analys och tolkning av data, utarbetande av artikeln och översyn av den för viktigt intellektuellt innehåll och slutligt godkännande av den version som ska lämnas in. Författarna tackar Can Sabuncuoğlu för hans vänliga ansträngningar för produktion av konstverket av den kirurgiska tekniken.

Materials

Buprenorphine  Par Pharmaceutical NDC 42023-179-05 For regional anesthesia
Isoflurane   Halocarbon Life Sciences NDC 66794-017-25 For general anesthesia
Magnification glasses USA Medical-Surgical SLR-250LBLK At least 2.5x
Nikon 90i microscope Nikon 3417 Motorized Fluorescence
Nucleospin Tissue Kit  Macherey-Nagel, Düren, Germany 740952.5 DNA isolation
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher, IL, USA 23225 Protein quantification
Polyglactin suture Ethicon VCP451H 4-0, 24 mm, cutting
Polylysine slides  VWR  48382-117 Microscope adhesion slides
Polypropylene suture Ethicon Y432H 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint
RIPA buffer  Sigma-Aldrich, Missouri, USA R0278-50ml Protein isolation
Silk suture Ethicon VCP682G 4-0, 24 mm, cutting
Trizol  Invitrogen  15596026 RNA isolation

References

  1. Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
  2. Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
  3. Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
  4. Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
  5. Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
  6. Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
  7. Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
  8. Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
  9. Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
  10. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  11. Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
  12. Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
check_url/61772?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Aydın, E., Joshi, R., Oria, M., Lim, F., Varisco, B. M., Peiro, J. L. Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice. J. Vis. Exp. (168), e61772, doi:10.3791/61772 (2021).

View Video