Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana
Summary
Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con GFP en Nicotiana benthamiana. Este protocolo se puede extender a la purificación y visualización de numerosas proteínas que utilizan cromatografía de columna. Además, el protocolo es adaptable al laboratorio de enseñanza en persona y en la universidad virtual, proporcionando una exploración basada en proyectos.
Abstract
La alta demanda de anticuerpos como intervenciones terapéuticas para diversas enfermedades infecciosas, metabólicas, autoinmunes, neoplásicas y otras factores crea una creciente necesidad en el desarrollo de métodos eficientes para la producción de anticuerpos recombinantes. A partir de 2019, había más de 70 anticuerpos monoclonales aprobados por la FDA, y hay un potencial de crecimiento exponencial. A pesar de su promesa, los factores limitantes para un uso generalizado son los costos de fabricación y la complejidad. Potencialmente, las plantas ofrecen estrategias de fabricación de proteínas de bajo costo, seguras y fácilmente escalables. Plantas como Nicotiana benthamiana no sólo pueden plegar y ensamblar correctamente proteínas complejas de mamíferos, sino que también pueden añadir modificaciones post-traduccionales críticas similares a las ofrecidas por los cultivos celulares de mamíferos. En este trabajo, mediante el uso de GFP nativa y una variante ácida estable de proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con anticuerpos monoclonales humanos, pudimos visualizar todo el proceso transitorio de expresión y purificación de anticuerpos de plantas N. benthamiana. Dependiendo del propósito del experimento, la fusión nativa de GFP puede garantizar una visualización más fácil durante la fase de expresión en las plantas, mientras que la fusión de PFN estable en ácido permite la visualización durante el procesamiento posterior. Este procedimiento escalable y directo puede ser realizado por un solo investigador para producir cantidades de miligramos de proteínas de fusión de anticuerpos o anticuerpos altamente puras en cuestión de días utilizando sólo unas pocas plantas pequeñas. Tal técnica puede extenderse a la visualización de cualquier tipo de proceso de purificación de anticuerpos y potencialmente muchas otras proteínas, tanto en plantas como en otros sistemas de expresión. Además, estas técnicas pueden beneficiar instrucciones virtuales y ser ejecutadas en un laboratorio de enseñanza por estudiantes de pregrado que poseen una experiencia previa mínima con técnicas de biología molecular, proporcionando una base para la exploración basada en proyectos con aplicaciones del mundo real.
Introduction
Los informes de la industria indican que trece de los veinte medicamentos más graves de los Estados Unidos eran biológicos (productos farmacéuticos a base de proteínas), de los cuales nueve eran anticuerpos. En 2019, había más de 570 terapias de anticuerpos (Ab) en varias fases de desarrollo clínico1,2,3. Las ventas globales actuales de Ab superan los 100 mil millones de dólares, y se espera que el mercado terapéutico monoclonal Ab (mAb) genere hasta 300 mil millones de USD para 20251,4. Con una demanda tan alta y aumentos proyectados de los ingresos, los investigadores han estado trabajando para desarrollar formas de producir terapias Ab a una escala cada vez mayor, con mayor calidad y menores costos. Los sistemas de expresión a base de plantas tienen varias ventajas sobre las líneas celulares tradicionales de mamíferos para la fabricación asequible y a gran escala de Ab therapeutics5,6. La producción de terapias proteicas en plantas (“pharming molecular”) no requiere costosos biorreactores o instalaciones de cultivo celular como lo hacen las técnicas tradicionales de cultivo celular de mamíferos7,8. Las plantas no pueden contraer patógenos humanos, minimizando la contaminación potencial9. Tanto la expresión de proteínas de origen vegetal transitoria como la transgénica pueden utilizarse como alternativas de menor costo a los sistemas de producción de mamíferos o bacterias10. Aunque las plantas transgénicas son preferidas para la producción de cultivos, la producción de proteína recombinante utilizando este método puede requerir semanas o meses. Los avances en la expresión transitoria utilizando vectores virales a través de jeringa o agroinfiltración al vacío permiten la producción a pequeña y gran escala, respectivamente, de la proteína deseada en los días11,12,13,14. La producción de mAbs contra el ébola, el dengue y el zika, y muchas otras proteínas recombinantes, se han producido y purificado rápida y eficientemente utilizando la expresión transitoria en las plantas de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Estas circunstancias hacen de la expresión transitoria a base de plantas una opción atractiva para el desarrollo de múltiples terapias Ab y los métodos demostrados en este protocolo20.
Los mAbs de primera generación eran de derivación murina, lo que dio lugar a una inmunogenicidad no específica cuando se utiliza en ensayos en humanos21. Con el tiempo, los Abs quiméricos, humanizados y, finalmente, totalmente humanos, se produjeron para disminuir la inmunogenicidad inducida por las terapias Ab. Desafortunadamente, algunos de estos Abdominales todavía causan inmunogenicidad del huésped debido a diferencias en la glicosilación21. Los desarrollos en la ingeniería de plantas han permitido la modificación de los glicanos Ab, lo que es esencial ya que la estabilidad y la función de un Ab pueden verse significativamente afectadas por su estado de glicosilación22. Los avances han permitido la producción en sistemas vegetales de expresión de alto nivel de mAbs humanizados, que contienen glicanos humanos y, como resultado, los rasgos biológicos deseados de un fármaco humano producido en masa19,21.
Además de Abs recombinante, las moléculas de fusión Ab (Ab fusiones) se han explorado para varios propósitos en las últimas décadas. Las fusiones Ab a menudo consisten en un fragmento de Ab o Ab fusionado con una molécula o proteína y están diseñadas para provocar respuestas de las células efectoras inmunitarias23. Estas moléculas han sido creadas como posibles intervenciones terapéuticas para tratar diversas patologías como el cáncer y las enfermedades autoinmunes24,25,26,27. Los complejos inmunes recombinantes (RC) son otra clase de fusiones Ab que se han empleado como candidatos a vacunas28. Los RC aprovechan la capacidad del sistema inmunitario para reconocer las regiones Fc de las fusiones Ab y se ha encontrado para mejorar la inmunogenicidad cuando se combina con otras plataformas de vacunas29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) es una proteína bioluminiscente derivada de la medusa Aequorea Victoria, que emite luz verde cuando se excita por la luz ultravioleta32,33. A lo largo de los años, el uso de GFP como marcador visual de expresión génica se ha expandido de la expresión en Escherichia coli a numerosos sistemas de expresión de proteínas, incluyendo plantas N. benthamiana 34,35,36,37,38. Los marcadores visibles, como la GFP, tienen abundantes implicaciones en la enseñanza y el aprendizaje de conceptos científicos. Numerosos estudiantes de nivel básico describen dificultades para captar conceptos científicos cuando la idea que se enseña no es visible a simple vista, como los conceptos de biología molecular y campos relacionados39. Por lo tanto, los marcadores visuales, como la GFP, pueden contribuir al procesamiento de la información relacionada con los procesos científicos y podrían ayudar a reducir las dificultades que los estudiantes reportan para aprender numerosos conceptos científicos.
Aunque la GFP se utiliza a menudo como un marcador para indicar el gen y la expresión in vivo,es difícil visualizarlo en los procesos posteriores si se utilizan condiciones ácidas. Esta circunstancia se debe principalmente a que la GFP no mantiene su estructura y la fluorescencia resultante a un pH bajo40. Los ambientes ácidos temporales a menudo son necesarios en varios procesos de purificación, tales como proteína G, proteína A, y cromatografía de proteína L, a menudo utilizado para la purificación Ab41,42,43,44. Los mutantes GFP se han utilizado para retener la fluorescencia en condiciones ácidas45,46.
Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de proteínas de fusión IgG recombinantes en plantas N. benthamiana. Producimos GFP tradicional fusionado con el N-terminus de una cadena pesada IgG humanizada, creando una fusión GFP-IgG. Simultáneamente, desarrollamos la fusión de una secuencia optimizada para codón de planta para un GFP estable en ácido (asGFP) al N-terminus de una cadena pesada IgG humanizada, creando una fusión asGFP-IgG. Las ventajas de producir GFP-IgG incluyen la capacidad de visualizar la presencia de una proteína diana durante la expresión, mientras que asGFP-IgG permite ver la presencia de proteína recombinante no sólo en los pasos de expresión y extracción, sino también en los pasos de purificación de la proteína. Este protocolo se puede adaptar para la producción, purificación y visualización de una gama de proteínas de fusión GFP producidas en N. benthamiana y purificadas mediante técnicas de cromatografía que requieren un pH bajo. El proceso también se puede adaptar a varias cantidades de material de hoja. Si bien el abs y las proteínas de fusión etiquetadas con GFP o asGFP no están destinadas a ser utilizadas para terapias, estos métodos pueden ser útiles como controles durante los experimentos y también pueden utilizarse como una herramienta de enseñanza para la biología molecular y celular y la biotecnología, tanto en persona como virtualmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se puede utilizar para la verificación visual de cualquier proteína recombinante Ab o recombinante producida en plantas N. benthamiana, incluidas aquellas que requieren exposición temporal a ambientes ácidos para fines de purificación decolumnas 42,43,44. Además, la fusión de asGFP a otras proteínas en diferentes sistemas de expresión puede ser una herramienta útil para la visualización y educa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Maria Pia DiPalma por editar el vídeo. También agradecemos a la Oficina de Alcance Educativo y Servicios Estudiantiles de la Universidad Estatal de Arizona por su generosa asistencia de cuota de publicación. La investigación para este protocolo fue apoyada por la Escuela de Ciencias de la Vida de la Universidad Estatal de Arizona.
Materials
| 5 mL syringe | any | N/A | |
| 50 mL syringe | any | N/A | |
| Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| Blender with cups | any | N/A | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| Heating block | any reputable supplier | N/A | |
| Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
| Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
| PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
| Polypropylene Column | any | N/A | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
| Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
| Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
| Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
| TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| UV lamp | any | N/A | |
| Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
| Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
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