Isolering og funksjonell vurdering av humane brystkreftstamceller fra celle- og vevsprøver

Summary

Denne eksperimentelle protokollen beskriver isoleringen av BCSC-er fra brystkreftcelle- og vevsprøver, samt in vitro – og in vivo-analysene som kan brukes til å vurdere BCSC-fenotype og funksjon.

Abstract

Brystkreft stamceller (BCSCs) er kreftceller med arvelige eller ervervede stamcellelignende egenskaper. Til tross for deres lave frekvens, er de store bidragsytere til brystkreftinitiering, tilbakefall, metastase og terapiresistens. Det er viktig å forstå biologien til brystkreft stamceller for å identifisere nye terapeutiske mål for å behandle brystkreft. Brystkreft stamceller er isolert og karakterisert basert på ekspresjon av unike celleoverflatemarkører som CD44, CD24 og enzymatisk aktivitet av aldehyddehydrogenase (ALDH). Disse^ALDH-høyeCD44 ⁺ CD24-cellene utgjør ^{BCSC-populasjonen} og kan isoleres ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for nedstrøms funksjonelle studier. Avhengig av det vitenskapelige spørsmålet, kan forskjellige in vitro og in vivo metoder brukes til å vurdere de funksjonelle egenskapene til BCSC. Her gir vi en detaljert eksperimentell protokoll for isolering av humane BCSC-er fra både heterogene populasjoner av brystkreftceller, samt primært tumorvev oppnådd fra brystkreftpasienter. I tillegg fremhever vi nedstrøms in vitro og in vivo funksjonelle analyser, inkludert kolonidannende analyser, mammosfæreanalyser, 3D-kulturmodeller og tumor xenograftanalyser som kan brukes til å vurdere BCSC-funksjonen.

Introduction

Å forstå de cellulære og molekylære mekanismene til humane brystkreftstamceller (BCSC) er avgjørende for å takle utfordringene som oppstår i brystkreftbehandling. Fremveksten av BCSC-konseptet dateres tilbake til begynnelsen^{av det} 21. århundre, hvor en liten populasjon av CD44 ⁺ CD24^{– / lave} brystkreftceller ble funnet å være i stand til å generere heterogene svulster hos mus ^1,2. Deretter ble det observert at humane brystkreftceller med høy enzymatisk aktivitet av aldehyddehydrogenase (ALDH^høy) også viste lignende stamcellelignende egenskaper³. Disse BCSC-ene representerer en liten populasjon av celler som er i stand til selvfornyelse og differensiering, noe som bidrar til den heterogene naturen til bulktumorer ^1,2,3. Akkumulerende bevis tyder på at endringer i evolusjonært konserverte signalveier driver BCSC-overlevelse og vedlikehold 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . I tillegg har cellens ekstrinsiske mikromiljø vist seg å spille en sentral rolle i å diktere forskjellige BCSC-funksjoner^15,16,17. Disse molekylære banene og de eksterne faktorene som regulerer BCSC-funksjonen bidrar til tilbakefall av brystkreft, metastase¹⁸ og utvikling av resistens mot terapier 19,20,21, med gjenværende eksistens av BCSC etter behandling som utgjør en stor utfordring for den totale overlevelsen av brystkreftpasienter^22,23 . Preklinisk evaluering av disse faktorene er derfor svært viktig for å identifisere BCSC-målrettede terapier som kan være gunstige for å oppnå bedre behandlingsresultater og forbedret total overlevelse hos brystkreftpasienter.

Flere in vitro humane brystkreftcellelinjemodeller og in vivo humane xenograftmodeller har blitt brukt til å karakterisere BCSCs 24,25,26,27,28,29. Cellelinjenes evne til kontinuerlig å repopulere etter hver påfølgende passasje gjør disse til et ideelt modellsystem for å utføre omics-baserte og farmakogenomiske studier. Imidlertid klarer cellelinjer ofte ikke å rekapitulere heterogeniteten observert i pasientprøver. Derfor er det viktig å utfylle cellelinjedata med pasientavledede prøver. Isolering av BCSC-er i sin reneste form er viktig for å muliggjøre detaljert karakterisering av BCSC. Å oppnå denne renheten avhenger av valg av fenotypiske markører som er spesifikke for BCSC. For tiden er ALDH^høyCD44 ⁺ CD24-celle fenotype mest brukt til å skille og isolere humane ^BCSC-er fra bulk brystkreftcellepopulasjoner ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for maksimal renhet^{1, 3,26}. Videre kan egenskapene til isolerte BCSC-er som selvfornyelse, spredning og differensiering evalueres ved hjelp av in vitro og in vivo teknikker.

For eksempel kan in vitro kolonidannende analyser brukes til å vurdere en enkelt celles evne til selvfornyelse for å danne en koloni på 50 celler eller mer i nærvær av forskjellige behandlingsforhold³⁰. Mammosfæreanalyser kan også brukes til å vurdere selvfornyelsespotensialet til brystkreftceller under forankringsuavhengige forhold. Denne analysen måler enkeltcellers evne til å generere og vokse som kuler (blanding av BCSC-er og ikke-BCSC-er) ved hver påfølgende passasje i serumfrie ikke-adherente kulturforhold³¹. I tillegg kan 3-dimensjonale (3D) kulturmodeller brukes til å vurdere BCSC-funksjonen, inkludert celle-celle- og cellematriseinteraksjoner som nøye rekapitulerer in vivo mikromiljøet og tillater undersøkelse av aktiviteten til potensielle BCSC-målrettede terapier³². Til tross for de ulike bruksområdene til in vitro-modeller, er det vanskelig å modellere kompleksiteten av in vivo-tilstander kun ved bruk av in vitro-analyser. Denne utfordringen kan overvinnes ved bruk av mus xenograft-modeller for å evaluere BCSC-oppførsel in vivo. Spesielt fungerer slike modeller som et ideelt system for å vurdere brystkreftmetastase 33, undersøke interaksjoner med mikromiljøet under sykdomsprogresjon 34, in vivo imaging³⁵, og for å forutsi pasientspesifikk toksisitet og effekt av antitumormidler³⁴.

Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse for isolering av human ALDH^høyCD44 ⁺ CD24^– BCSC ved maksimal renhet fra bulkpopulasjoner av heterogene brystkreftceller. Vi gir også en detaljert beskrivelse av tre in vitro-teknikker (kolonidannende analyse, mammosfæreanalyse og 3D-kulturmodell) og en in vivo tumor xenograftanalyse som kan brukes til å vurdere ulike funksjoner av BCSC. Disse metodene vil være hensiktsmessige for bruk av etterforskere som er interessert i å isolere og karakterisere BCSC-er fra humane brystkreftcellelinjer eller primærpasientavledede brystkreftceller og tumorvev med det formål å forstå BCSC-biologi og / eller undersøke nye BCSC-målrettede terapier.

Protocol

Innsamling av pasientavledede kirurgiske eller biopsiprøver direkte fra samtykkende brystkreftpasienter ble utført i henhold til godkjent humanetisk protokoll godkjent av institusjonens etiske styre. Alle mus som ble brukt til å generere pasientavledede xenograftmodeller ble vedlikeholdt og plassert i et institusjonsgodkjent dyreanlegg. Tumorvevet fra pasientavledede xenograftmodeller ved bruk av mus ble generert i henhold til godkjent etikkprotokoll godkjent av institusjonens dyrepleiekomité. <p class="jove_titl…

Representative Results

Den beskrevne protokollen tillater isolering av humane BCSC-er fra en heterogen populasjon av brystkreftceller, enten fra cellelinjer eller fra dissosiert tumorvev. For en gitt cellelinje eller vevsprøve er det avgjørende å generere en jevn enkeltcellesuspensjon for å isolere BCSC-er ved maksimal renhet, da forurensende ikke-BCSC-populasjoner kan resultere i variable cellulære responser, spesielt hvis studiemålet er å evaluere effekten av terapeutiske midler rettet mot BCSC. Bruk av en streng sorteringsstrategi vi…

Discussion

Brystkreftmetastase og motstand mot terapi har blitt en viktig årsak til dødelighet hos kvinner over hele verden. Eksistensen av en underpopulasjon av brystkreftstamceller (BCSC) bidrar til forbedret metastase 26,43,44,45,46 og terapiresistens ^21,47,48. Derfor bør …

Materials

7-Aminoactinomycin D (7AAD)	BD	51-68981E	suggested: 0.25 µg/1×106 cells
Acetone	Fisher	A18-1
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate	Stemcell Technologies	1700	Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation
Basement membrane extract (BME)	Corning	354234	Sold under the commercial name Matrigel
Cell culture plates: 6 well	Corning	877218
Cell culture plates: 60mm	Corning	353002
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment	Corning	3474
Cell strainer: 40 micron	BD	352340
Collagen	Stemcell Technologies	7001	Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS
Collagenase	Sigma	11088807001	1x
Conical tubes: 50 mL	Fisher scientific	05-539-7
Crystal violet	Sigma	C6158	Use 0.05% crystal violet solution in water for staining
Dispase	Stemcell Technologies	7913	5U/mL
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
DNAse	Sigma	D5052	0.1 mg/mL final concentration
FBS	Avantor Seradigm Lifescience	97068-085
Flow tubes: 5ml	BD	352063	Polypropylene round-bottom tubes
Methanol	Fisher	84124
mouse anti-Human CD24 antibody	BD	561646	R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5
mouse anti-Human CD44 antibody	BD	555479	R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stemcell Technologies	1700	Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation
PBS	Wisent Inc	311-425-CL	1x, Without calcium and magnesium
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Mammosphere Media Composition
B27	Gibco	17504-44	1x
bFGF	Sigma	F2006	10 ng/mL
BSA	Bioshop	ALB003	04%
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF	Sigma	E9644	20 ng/mL
Insulin	Sigma	16634	5 µg/mL
3D Organoid Media Composition
A8301	Tocris	2939	500 nM
B27	Gibco	17504-44	1x
DMEM:F12	Gibco	11330-032	1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES
EGF	Sigma	E9644	5 ng/mL
FGF10	Peprotech	100-26	20 ng/mL
FGF7	Peprotech	100-19	5 ng/mL
GlutaMax	Invitrogen	35050-061	1x
HEPES	Gibco	15630-080	10 mM
N-acetylcysteine	Sigma	A9165	1.25 mM
Neuregulin β1	Peprotech	100-03	5 nM
Nicotinamide	Sigma	N0636	5 mM
Noggin	Peprotech	120-10C	100 ng/mL
R-spondin3	R&D	3500	250 ng/mL
SB202190	Sigma	S7067	500 nM
Y-27632	Tocris	1254	5 µM