यह प्रोटोकॉल एलर्जी से अंतर्जात लिपिड को हटाने और रिवर्स-फेज एचपीएलसी के माध्यम से उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट लिगामेंट्स के साथ उनके प्रतिस्थापन का वर्णन करता है। 31 पी-एनएमआर और परिपत्र डिक्रोमिज़्म लिगांड हटाने/लोडिंग की तेजी से पुष्टि और देशी एलर्जी संरचना की वसूली के लिए अनुमति देते हैं।
कई प्रमुख एलर्जी हाइड्रोफोबिक लिपिड जैसे अणुओं से बांधते हैं, जिनमें मस एम 1, बेट वी 1, डेर पी 2 और फेल डी 1 शामिल हैं। इन लिगामेंट्स को दृढ़ता से बनाए रखा जाता है और संवेदीकरण प्रक्रिया को सीधे प्रतिरक्षा प्रणाली को उत्तेजित करने या एलर्जिक प्रोटीन के जैव भौतिक गुणों में फेरबदल करने की क्षमता होती है। इन चरों को नियंत्रित करने के लिए, अंतर्जात रूप से बंधे लिगामेंट्स को हटाने के लिए तकनीकों की आवश्यकता होती है और यदि आवश्यक हो, तो ज्ञात संरचना के लिपिड के साथ प्रतिस्थापन। तिलचट्टा एलर्जेन बला जी 1 एक बड़ी हाइड्रोफोबिक गुहा को संलग्न करता है जो पारंपरिक तकनीकों का उपयोग करते हुए शुद्ध होने पर अंतर्जात लिपिड के विषम मिश्रण को बांधता है। यहां, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जिसके माध्यम से इन लिपिड को रिवर्स-फेज एचपीएलसी का उपयोग करके हटा दिया जाता है जिसके बाद थर्मल एनीलिंग द्वारा अपने एपो-फॉर्म में बला जी 1 उपज या फैटी एसिड या फॉस्फोलिपिड कार्गो के उपयोगकर्ता-परिभाषित मिश्रण के साथ फिर से लोड किया जाता है। जैव रासायनिक परख के साथ इस प्रोटोकॉल युग्मन से पता चलता है कि फैटी एसिड कार्गो काफी टी सेल epitope पीढ़ी और एलर्जी की दर के लिए डाउनस्ट्रीम निहितार्थ के साथ, बीएलए जी 1 के थर्मोसिटी और प्रोटियोलिटिक प्रतिरोध को बदल देते हैं। ये परिणाम लिपिड हटाने/रीलोडिंग प्रोटोकॉल के महत्व को उजागर करते हैं जैसे कि यहां वर्णित जब दोनों पुनः संयोजन और प्राकृतिक स्रोतों से एलर्जी का अध्ययन करते हैं । प्रोटोकॉल लिपोकलिन (मस एम 1), पीआर-10 (बेट वी 1), एमडी-2 (डेर पी 2) और यूट्रोग्लोबिन (फेल डी 1) सहित अन्य एलर्जी परिवारों के लिए सामान्य रूप से महत्वपूर्ण है, जो एलर्जी प्रतिक्रिया में लिपिड की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।
एलर्जेन डेटाबेस के एक सर्वेक्षण से पता चलता है कि एलर्जी सभी ज्ञात प्रोटीन परिवारों के केवल 2% में पाई जाती है, आम कार्यात्मक और जैव भौतिक गुणों का सुझाव देता है जो एलर्जी1में योगदान देते हैं। इन गुणों में से, लिपिड कार्गो को बांधने की क्षमता एलर्जी के बीच दृढ़ता से अधिक प्रतिनिधित्व करती प्रतीत होती है, यह सुझाव देते हुए कि ये कार्गो संवेदीकरण प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं1। दरअसल, यह दिखाया गया है कि ब्राजील अखरोट एलर्जी Ber ई 1 अपने अंतर्जात लिपिड के साथ सह प्रशासन की आवश्यकता को अपनी पूरी संवेदनशील क्षमता2 काएहसास । ये लिपिड संभवतः प्रतिरक्षा प्रणाली को सीधे उत्तेजित कर सकते हैं जैसा कि पतंग एलर्जी डेर पी 2 और डेर पी 7 द्वारा दर्शाया गया है, जिनमें से दोनों एलपीएस-बाध्यकारीप्रोटीन3,4,5के साथ एक मजबूत संरचनात्मक होमोलॉजी साझा करते हैं। इस अवलोकन के आधार पर यह प्रस्ताव किया गया था कि डर्प 2 और डेर पी 7 बैक्टीरियल लिपिड को बांध सकते हैं और सीधे टीएलआर 4-मध्यस्थता सिग्नलिंग के माध्यम से मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रोत्साहित कर सकते हैं, जिससे संवेदीकरण प्रक्रिया5,6को सुविधाजनक बनाया जा सकता है। यह भी संभव है कि अंतर्जात रूप से बंधे लिपिड एलर्जी प्रोटीन के जैव भौतिक गुणों को बदल सकते हैं। उदाहरण के लिए, फॉस्फोलिपिड वेसिकल्स के साथ बातचीत करने के लिए पाप ए 2 (सरसों) और आरा एच 1 (मूंगफली) की क्षमता ने गैस्ट्रिक और एंडोसोमल क्षरण7के प्रति उनके प्रतिरोध को काफी बढ़ाया, जबकि प्रमुख बर्च पराग एलर्जेन बेट वी 1 के लिए बाध्यकारी लिगांड ने एंडोसोमल प्रसंस्करण की दर और परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स8की विविधता दोनों को बदल दिया। यह विशेष रूप से स्थिरता, टी-सेल एपिटोप जनरेशन और बेट वी 1 और बीएलए जी 1 जैसे प्रोटीन के लिए एलर्जी के बीच मनाया गया सहसंबंध को देखते हुए एलर्जी के लिए प्रासंगिक है; जिनमें से बाद इस काम का विषय होगा9,10.
बला जी 1 कीट मेजर एलर्जेन (एमए) प्रोटीन परिवार के प्रोटोटाइप सदस्य का प्रतिनिधित्व करता है, और 12 एम्फीपैथिक अल्फा हेलीस से बना एक अद्वितीय संरचना है जो असामान्य रूप से बड़े हाइड्रोफोबिक गुहा9,11को संलग्न करता है। बीएलए जी 1 की उपलब्ध एक्स-रे क्रिस्टल संरचना इस गुहा के भीतर इलेक्ट्रॉन घनत्व दिखाती है जो बाउंड फॉस्फोलिपिड या फैटी एसिड लिगामेंट्स के अनुरूप है; 31पी-एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पुष्टि की गई अनुमान। ये कार्गो प्रकृति में विषम थे और उनकी संरचना एलर्जी स्रोत पर भारी निर्भर थी, जिसमें ई कोलाई और पी पादरीमें व्यक्त किए गए पुनर्संयोजन ब्ला जी 1 के लिए विभिन्न लिपिड प्रोफाइल मनाए गए थे। मजे की बात है, बला जी 1 अपने प्राकृतिक एलर्जी स्रोत (तिलचट्टा फ्रास) से शुद्ध होता है, जिसमें मुख्य रूप से फैटी एसिड होते हैं, जिसमें पामिट, ओलेट और स्टीरेट के मिश्रण को इसके “प्राकृतिक” लिगांड9,11के रूप में पहचाना जाता है। कई शुद्धिकरण चरणों के बाद लिपिड और फैटी एसिड को बनाए रखने के लिए बला जी 1 की क्षमता अलगाव में प्रोटीन का अध्ययन करने के प्रयासों में बाधा डालती है। इसके विपरीत, यह सुझाव दिया गया है कि बीएलए जी 1 (अब से एनएमआईएक्स के रूप में संदर्भित) के प्राकृतिक पल्मिटेट, स्टेरेट, और ओलेट लिगांड अपनी एलर्जी और देशी जैविक समारोह9दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, ये लिगामेंट्स रीकॉम्बिनेंट स्रोतों से प्राप्त बीएलए जी 1 में मौजूद नहीं हैं, जिससे इस परिकल्पना का आकलन करना मुश्किल हो जाता है। इसी तरह के मुद्दे अन्य लिपिड बाइंडिंग एलर्जी जैसे बेट वी1 12,13के लिए देखे गए हैं । लिपिड-एलर्जेन इंटरैक्शन के व्यवस्थित अध्ययन को सुगम बनाने के लिए हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसके माध्यम से एलर्जी को मात्रात्मक रूप से उनके अंतर्जात लिपिड से छीन लिया जा सकता है और या तो एपो-फॉर्म में पुनर्गठित किया जा सकता है या विशिष्ट लिगांड से भरा हुआ है।
एलर्जेंस को आमतौर पर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी और/या आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके उनके प्राकृतिक या पुनर्संयोजन स्रोतों से शुद्ध किया जाता है । यहां, हम उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) के रूप में एक अतिरिक्त शुद्धिकरण कदम पेश करते हैं, जिसमें रिवर्स-फेज C18 कॉलम को नियोजित किया गया है, जिसमें से एलर्जी को फैटी एसिड बाइंडिंग प्रोटीन14के लिए विकसित प्रोटोकॉल के समान एक कार्बनिक विलायक में शामिल किया गया है। परिणामस्वरूप प्रोटीन तो फैटी एसिड और/या फॉस्फोलिपिड की अनुपस्थिति या उपस्थिति में एक थर्मल एनीलिंग कदम के अधीन है । देशी बला जी 1 गुना ठीक करने के अलावा, ऊंचा तापमान लिपिड कार्गो की घुलनशीलता और पहुंच में वृद्धि करता है, या तो एपो-फॉर्म में बला जी 1 उपज या वांछित हाइड्रोफोबिक लिगामेंट से समान रूप से भरा हुआ है। 31 इस तरह से शुद्ध बीएलए जी 1 के पी-एनएमआर स्पेक्ट्रा ने वांछित यौगिकों के साथ अंतर्जात रूप से बंधे लिगामेंट्स और समान प्रतिस्थापन को पूरी तरह से हटाने की पुष्टि की, जबकि परिपत्र डिक्रोवाद ने बला जी 1 गुना की सफल वसूली की पुष्टि की। इस विधि की उपयोगिता को हाल के एक काम में रेखांकित किया गया है जिसमें कार्गो बाइंडिंग को बला जी 1 थर्मोस्थेबिलिटी और प्रोटियोलिटिक प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए पाया गया था, जो संवेदीकरण और एलर्जी9के संभावित प्रभावों के साथ टी-सेल एपिटोप उत्पादन की गतिज में फेरबदल करता था।
इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक बला जी 1 के लिपिड बाध्यकारी गुणों का व्यवस्थित अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। इससे कार्गो बाइंडिंग, थर्मोस्थेबिलिटी और एंडोसोमल प्रोसेसिंग के बीच एक स?…
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ टॉम किर्बी, स्कॉट Gabel, और डॉ रॉबर्ट लंदन इस काम के दौरान उनकी मदद और सहायता के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, डॉ बॉब पेट्रोविच और लोरी एडवर्ड्स के साथ उनके इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग और इस अध्ययन में नियोजित बीएलए जी 1 निर्माण पैदा करने में उनकी सहायता के लिए । हम एंड्रिया एडम्स को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं, और एनएमआर इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ सहायता के लिए डॉ यूजीन डिरोज। इस शोध को एनआईएच, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरमेंटल हेल्थ साइंसेज, जेड01-ES102906 (गाम) के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।
Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
VnmrJ (Software) | Varian | N/a |