Этот протокол представляет собой новую, надежную и воспроизводимую культурную систему для генерации и выращивания трехмерных сфероидов из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2. Результаты обеспечивают первое доказательство-концепции для целесообразности этого подхода к изучению биологии раковых стволовых клеток, в том числе ответ на химиотерапию.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трехмерная модель сфероидов для изучения стволовых клеток рака толстой кишки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Колоректальный рак характеризуется неоднородностью и иерархической организацией, состоящей из группы раковых стволовых клеток (ККС), ответственных за развитие опухоли, поддержание и устойчивость к наркотикам. Таким образом, более глубокое понимание свойств CSC для их конкретного таргетинга является необходимым условием для эффективной терапии. Однако существует нехватка подходящих доклинических моделей для углубленных исследований. Хотя в пробирке двумерных (2D) линий раковых клеток обеспечивают ценную информацию в биологии опухоли, они не повторяют фенотипической и генетической неоднородности опухоли. В отличие от этого, трехмерные (3D) модели адрес и воспроизвести почти физиологические сложности рака и клеточной неоднородности. Целью этой работы было проектирование надежной и воспроизводимой системы 3D-культуры для изучения биологии CSC. Нынешняя методология описывает развитие и оптимизацию условий для генерации 3D сфероидов, которые являются однородными по размеру, из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2, модели, которая может быть использована для долгосрочной культуры. Важно отметить, что в сфероидах, клетки, которые были организованы вокруг люменоподобных структур, характеризовались дифференциальными моделями распространения клеток и наличием CSCs, выражаюющих панель маркеров. Эти результаты являются первым доказательством целесообразности этого 3D-подхода для изучения клеточной неоднородности и биологии CSC, включая реакцию на химиотерапию.
Введение
Колоректальный рак (CRC) остается второй ведущей причиной связанных с раком смертей в мире1. Развитие CRC является результатом прогрессивного приобретения и накопления генетических мутаций и/или эпигенетическихизменений 2,3,включая активацию онкогенов и инактивацию генов супрессораопухоли 3,4. Кроме того, негенекогенные факторы (например, микроокнирония) могут способствовать и способствовать онкогенной трансформации и, таким образом, участвовать в эволюции CRCs5. Важно отметить, что CRCs состоят из различ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о всех реагентов и материалов перечислены в таблице материалов.
1. Образование сфероидов
- Сфероидная культура СМИ
- Подготовка базальной среды, состоящей из модифицированных Игл Средний Dulbecco (DMEM) дополнен 4 мММ L-аланил-L-глутамин дипептида.
- Подготовка DMEM полной среды, содержащей 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин (Pen/Strep) в базальной среде от шага 1.1.1.
- Подготовка DMEM / подвал мембраны матрицы среды, содержащей 2,5% подвал мембраны матрицы, 10% FBS, и 1% Пен / Strep в базальной среде от шага 1.1.1.
....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Поскольку отсутствие однородности в размерах сфероидов является одним из основных недостатков имеющихся в настоящее время 3D систем сфероиднойкультуры 13,целью этой работы было создать надежный и воспроизводимый протокол для получения однородных сфероидов. Во-первых, чтобы создать идеальные условия труда, различные числа клеток Caco2 были протестированы, начиная от 50 до 2000 клеток на микроуэлл / сфероид с помощью выделенных пластин (Таблица 1). П.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
3D-модели In vitro преодолевают основные экспериментальные недостатки 2D культур раковых клеток, поскольку они кажутся более надежными в повторном воспроизведении типичных опухолевых особенностей, включая микроокноронность и неоднородность клеток. Обычно используемые 3D-модели сфероидов не имеют эшафота (культурны в условиях низкой привязанности) или на основе эшафота (с использованием биоматериалов для культурных клеток). Эти методы представляют различные недостатки, поскольку они зависят от характера эшафот используетс.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать
Благодарности
Мы признаем, изображения и Anipath recherche гистологии платформ (CRCL, CLB). Мы в долгу перед аптекой больницы Центра Леона Берарда (CLB) за добрый подарок FOLFOX и FOLFIRI. Мы также благодарим Брижит Химан за критическое прочтение рукописи. Работа была поддержана FRM (Equipes FRM 2018, ДЕЗ20181039598) и инков (PLBIO19-289). MVG и LC получили поддержку от FRM и CF, получивших поддержку от фонда ARC и Центра Леона Берарда.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 37 & микро; m Реверсивный сетчатый фильтр, большой | STEMCELL Technologies | 27250 | Для использования с коническими пробирками объемом 50 мл |
| 5-фторурацил | Подарок от аптеки Центра Леона Берарда (CLB) | - | стоковый раствор, 5 мг/100 мл; конечная концентрация, 50 мкг; г/мл |
| Агароза | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-луночные планшеты | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 микролунок на лунку для формирования и роста сфероидов |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | разведение 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | разведение 1:500 |
| Раствор для промывки против прилипания x 100 мл | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Крыса | Invitrogen | 14-133-82 | разведение 1:100 |
| Анти-CD44 -Кролик | Abcam | ab157107 | разведение 1:2000 |
| Анти-PCNA - Мышь | Dako | M0879 | разведение 1:1000 |
| Анти-&бета;-катенин - Мышь | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | разведение 1:50 |
| Черный многолуночные планшеты | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| моногидрат лимонной кислоты | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar аппарат | BMG Labtech | считыватель микропланшетов | |
| Dako ручка | маркер для обозначения кругов на предметных стеклах для создания барьеров для жидкостей | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | разведение 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Вторичное антитело, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | разведение 1:1000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | разведение 1:1000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | разведение 1:1000 |
| Модифицированная Eagle Medium (DMEM) Dulbecco's Glutamax (L-аланил-L-глутамин дипептид) | Gibco | 10569010 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Фторогель монтажная среда с DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| козье антикрысиное антитело IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | разведение 1:1000 |
| Программное обеспечение | Анализ сфероидальных изображений | ||
| Иринотекан& НБСП; | Подарок от аптеки CLB-стоковый | раствор, 20 мг/мл; конечная концентрация, 100 мкм; g/ml | |
| iScript обратная транскриптаза | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB-stock | раствор, 50 мг/мл; конечная концентрация, 25 мкм; г/мл | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Оксалиплатин | Подарок из аптеки CLB-стоковый | раствор, 100 мг/20 мл; г/мл | |
| пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140130 | |
| фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX - зеленый | Thermo Fisher Scientific | S7020 | ; разведение 1:5000 |
| Трипсин-ЭДТА (0,05 %) | Gibco | ||
| Инвертированный микроскоп | Zeiss-Axiovert |
Ссылки
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
