Denne protokollen gir en metode for å studere Mycobacterium tuberkuloseinfeksjon i humane M1- eller M2-polariserte makrofager basert på differensiering av perifere blod-monocytter til makrofaglignende celler som er infisert med den GFP-merkede virulente stammen H37Rv, og analysert med strømningscytometri ved hjelp av et 10-fargers panel inkludert uttrykk for utvalgte M1 / M2-markører.
Menneskelige makrofager er primære vertsceller av intracellulær Mycobacterium tuberkulose (Mtb) infeksjon og har dermed en sentral rolle i immunkontroll av tuberkulose (TB). Vi har etablert en eksperimentell protokoll for å følge immunpolarisering av myeloid-avledede celler i M1 (klassisk aktivert) eller M2 (alternativt aktivert) makrofaglignende celler gjennom vurdering med et 10-fargers strømningscytometripanel som tillater visualisering og dyp karakterisering av grønn-fluorescerende protein (GFP) merket Mtb i forskjellige makrofager. Monocytter hentet fra friske blodgivere ble polarisert til M1- eller M2-celler ved hjelp av differensiering med granulocytt makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) eller makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) etterfulgt av polarisering med henholdsvis IFN-γ og lipopolysakkarid (LPS) eller IL-4. Fullt polariserte M1- og M2-celler ble smittet med Mtb-GFP i 4 timer før frittliggende Mtb-infiserte makrofager ble farget med strømningscytometri ved 4- eller 24-timers postinfeksjon. Prøveanskaffelse ble utført med flowcytometri og dataene ble analysert ved hjelp av en programvare for flytcytometrianalyse. Manuell gating samt dimensjonalitetsreduksjon med Uniform Manifold Tilnærming og projeksjon (UMAP) og fenografianalyse ble utført. Denne protokollen resulterte i effektiv M1/M2-polarisering preget av forhøyede nivåer av CD64-, CD86-, TLR2-, HLA-DR- og CCR7 på uinfiserte M1-celler, mens uinfiserte M2-celler viste en sterk oppregulering av M2-fenotypemarkørene CD163, CD200R, CD206 og CD80. M1-polariserte celler inneholdt vanligvis færre bakterier sammenlignet med M2-polariserte celler. Flere M1/M2-markører ble nedregulert etter Mtb-infeksjon, noe som tyder på at Mtb kan modulere makrofagpolarisering. I tillegg ble 24 forskjellige celleklynger av forskjellige størrelser funnet å være unikt fordelt mellom M1 og M2 uinfiserte og Mtb-infiserte celler ved 24-timers etterinfeksjon. Denne M1/M2 strømningscytometriprotokollen kan brukes som ryggrad i Mtb-makrofagforskning og vedtas for spesielle behov på ulike forskningsområder.
Makrofager er immunceller som bidrar betydelig til regulering av vev homeostase, betennelse og sykdom patologier. Å være en viktig komponent i medfødt immunitet, uttrykker monocytt-makrofaglinjen av celler heterogene fenotyper som svar på endrede miljøsignaler, som gjenspeiler deres plastisitet og tilpasning til forskjellige anatomiske og immunologiske steder1. Avhengig av vekstfaktorene, cytokiner og andre mediatorer tilstede i mikromiljøet, har makrofager blitt kategorisert i to store reversible populasjoner, hver med en annen rolle i bakteriell kontroll og clearance2: de proinflammatoriske, klassisk aktiverte M1-polariserte makrofagene og de antiinflammatoriske, alternativt aktiverte M2-polariserte makrofagene som opprinnelig ble navngitt for å etterligne T-hjelper (Th) celle nomenklatur3. Denne grupperingen av immunpolariserte makrofager betraktes ofte som forenklet, da makrofagaktivering og differensiering ikke er lineær, men mer nøyaktig illustrert som et kontinuum der hver befolkning har forskjellige egenskaper og funksjonelle roller i utfallet av sykdomsutvikling og progresjon4,5,6,7. Likevel er det mange eksperimentelle fordeler med M1 / M2 makrofagmodellen som kan brukes på flere forskjellige forskningsfelt.
Mycobacterium tuberkulose (Mtb) er årsaksmiddelet til tuberkulose (TB) og har blitt estimert til å infisere en person hvert sekund og regnes som det mest dødelige enkelt smittsomme middelet i verden (Global TB rapport 2019). Siden luftveiene er hovedveien for Mtb-infeksjon, er alveolar makrofager de foretrukne vertscellene som skal smittes med Mtb og representerer både de primære barrierene og det smittsomme reservoaret for Mtb i lungene. Makrofag polarisering som svar på ulike stimuli har blitt grundig studert gjennom årene7 og i det meste av det publiserte arbeidet, M1 polarisering av monocyttkulturer in vitro er indusert av Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) sammen med IFN-γ og LPS8,9, mens M2 polarisering er indusert med Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF) og IL-410,11. M1 makrofager er potente effektorceller som formidler antimikrobielle responser mot intracellulære patogener og har en viktig rolle i antitumorimmunitet12. M2 makrofager har derimot en antiinflammatorisk funksjon, høy fagocytisk kapasitet og er hovedsakelig involvert i sårheling og vevsreparasjon samt i parasittinfeksjoner12. Følgelig blir M1 makrofager sett på som mer effektive i intracellulær kontroll av Mtb sammenlignet med M2 makrofager13. Imidlertid har Mtb-bakterier også potensial til å modulere makrofagpolarisering for å undergrave medfødt immunitet14,15,16,17.
Selv om det er vanlig å generere makrofager fra differensiering av monocytter hentet fra perifert blod18, kan makrofager også genereres fra induserte pluripotente stamceller (iPSCer)19 eller fra benmargsavledede makrofager fra mus20,21. Dette er gjennomførbare teknikker for å studere primære makrofagceller hentet fra monocytt/ makrofag forfedre som vil spre seg og skille seg ut i en homogen populasjon av modne makrofaglignende celler. Imidlertid gir disse protokollene sjelden fordypet kunnskap om fenotypen og funksjonen til cellene som er oppnådd, og tar heller ikke hensyn til den naturlige heterogeniteten som observeres blant makrofager oppnådd in vivo. Siden Mtb er et strengt menneskelig patogen, er det også en fordel å studere Mtb i humaniserte modellsystemer. Flow cytometri er en kraftig teknologi som gir muligheten til å vurdere flere fenotypiske og funksjonelle egenskaper til enkeltceller i suspensjon22, noe som kan være ganske utfordrende med tilhengerceller som makrofager som også er kjent for å være autofluorescent23,24. I tillegg til kjemisk løsrivelse av fast tilhenger makrofager, kan Mtb-infeksjon utgjøre en betydelig stressfaktor for cellene som tilfører et annet nivå av kompleksitet i strømningscytometriske analyser av Mtb-infiserte makrofager.
I denne eksperimentelle protokollen har vi brukt en tidligere etablert human makrofaginfeksjonsmodell basert på immunpolarisering av primære perifere-blod-monocytt-avledede celler som er infisert med det virulente laboratoriet Mtb-stammen H37Rv, og analysert med strømningscytometri ved hjelp av et 10-fargers panel inkludert uttrykk for utvalgte M1- og M2-markører25. Denne protokollen gir en effektiv og reproduserbar metode for å studere respons på Mtb-infeksjon i M1 eller M2 polariserte monocyttavledede makrofager. I tillegg tillater bruk av strømningscytometri på tilhenger Mtb-infiserte makrofager oss å studere en rekke overflatemarkører forbundet med konvensjonelle M1- og M2-makrofager og deres langsgående respons på Mtb-infeksjon. Viktigst, denne protokollen kan lett vedtas for undersøkelser av infeksjoner med andre patogener, i anti-tumor studier eller i studier av inflammatoriske forhold, for narkotika screening etc. og kan også utnyttes til vurdering av M1 / M2 makrofag polarisering i menneskelige kliniske prøver.
Denne eksperimentelle protokollen beskriver effektiv polarisering av myeloid-avledede celler i M1- eller M2-fenotyper, inkludert vurdering med et 10-fargers strømningscytometripanel som tillater visualisering og dypkarakterisering av GFP-merket Mtb i forskjellige makrofager. Selv om TB er en gammel menneskelig sykdom, er det for tiden ingen gylden standardmodell for å studere Mtb-makrofaginteraksjoner, og flerfarget strømningscytometri av makrofager kan være komplisert sammenlignet med analyser av lymfocyttresponser. Få tilgjengelige protokoller for in vitro differensiering av menneskelige monocytter til makrofager presenterer dyp kunnskap om hvilken type makrofager som genereres. En grunnleggende protokoll for makrofagpolarisering og strømningscytometrisk vurdering av makrofagaktivering ved hjelp av et solidt panel av markører kan sannsynligvis lette slik karakterisering og gi muligheter til å utforske flere funksjoner i polariserte celler behandlet under forskjellige forhold. Dette inkluderer analyser av celler dyrket in vitro samt analyser av celler in vivo i kliniske prøver, det vil si både PBMC og encellede suspensjoner fra kroppsvæsker (dvs. bronkoalveolar lavage) eller homogenisert vev. Følgelig kan differensierings- og/eller aktiveringsstatus for monocytter og makrofager oppnådd fra pasienter være relatert til sykdomsutfall. Utvidelse av CD16+CD163+ monocytter i perifert blod er rapportert hos lunge TB-pasienter30. En økt frekvens av CD163+ celler ble også påvist i betent hud av atopisk dermatitt pasienter31. På samme måte har CD206+ M2-lignende makrofager vist seg å hemme spredning og differensiering av celler i mikromiljøet av adipocyttvev32 og å bli beriket i benmargsprøver fra pasienter med akutt myeloid leukemi (AML)29. Et forhøyet forhold mellom CD64 (M1) og CD163 (M2) celler i fullblod av pasienter med slitasjegikt ble funnet å være forbundet med sykdomalvorlighetsgrad 33. En annen studie brukte CD86 (M1) og CD163 (M2) for å demonstrere at høyt M1-uttrykk i vev korrelert med verre utfall i en undergruppe av ondartede hjernesvulster34.
Det er flere betydelige fordeler med denne eksperimentelle M1/M2 flowcytometriprotokollen. Denne modellen gir mulighet til å studere medfødte immunresponser på virulente Mtb-infeksjon og kan utvikles for å inneholde studier av adaptive immunresponser ved å legge til autologe T-celler sammen med M1- eller M2-makrofager i blandede lymfocyttreaksjoner (MLR). Protokollen er også egnet for legemiddelscreening og testing av ulike immunmodulerende og antimikrobielle forbindelser. Her har vi tidligere studert effekten av vitamin D og histon deacetylasehemmer fenylbutyrate på myeloid-avledede celler etter Mtb-infeksjon25,35. M1/M2 strømningscytometri kan også brukes til å vurdere makrofagaktivering etter kondisjonering med cellekultur supernatanter eller pasientplasma. Mens in vivo studier av TB co-infeksjon med HIV eller helminter eller TB-diabetes co-morbidity kan være utfordrende, den mindre komplekse M1 / M2 modellen kan lette studier av co-morbidities in vitro. På samme måte kan protokollen utnyttes til overføringsstudier for å undersøke Mtb-infektiviteten til celler eller for å undersøke fagocytisk så vel som antigenpresentasjonskapasitet for individuelle M1/ M2-celler. M1/M2 strømningscytometri er også attraktivt for bruk i biomarkør- og vaksinestudier, for å følge sykdomsprognose under behandling og for å teste terapier rettet mot myeloid-avledede celler. Det er viktig at en rekke ulike metoder kan anvendes parallelt med strømningscytometri for samtidig vurdering av makrofag polariseringsfenotyper og funksjonelle responser ved hjelp av konfokal mikroskopi (figur 3D), sanntids PCR, western blot, multipleksanalyser og ELISA av løselige faktorer i kulturen supernatant samt vurdering av intracellulær bakteriell infektivitet og vekst ved hjelp av GFP-uttrykk (strømningscytometri og konfokal mikroskopi) og kolonidannende enheter (CFU). Infeksjon av M1- eller M2-celler med Mtb-GFP-bakterier gjør det også mulig å sortere de uinfiserte og Mtb-infiserte cellene fra samme prøve for enkeltcelle-RNA sekvenseringsanalyse.
Den beskrevne protokollen har også noen begrensninger, inkludert både tekniske og vitenskapelige ulemper. Ulempen ved å bruke monocytt-avledede makrofager fra menneskelige blodgivere er at donorvariabiliteten ofte er høy og det faktum at cellene ikke polariseres i det fysiologiske miljøet i menneskelig vev. Stor variasjon i polariseringseffekten M1/M2 eller Mtb-infectivity mellom donorer kan føre til problemer med både intra- og intereksperimentale variasjoner, lav statistisk kraft og et behov for å inkludere mange givere for å oppnå pålitelige resultater. I tillegg resulterer plasttilslutning av monocytter fra PBMCer i et donoravhengig antall monocytter/brønn som til slutt kan gi en vilkårlig MOI som kan påvirke makrofagpolariseringen og celle levedyktigheten etter Mtb-infeksjon. Kritiske trinn i protokollen innebærer riktig vasking for å forhindre at andre celletyper forurenser cellekulturene som også kan påvirke makrofagpolariseringen. Mens en for lav MOI kan etterligne latent TB-infeksjon, vil en for høy MOI drepe cellene, og fremheve viktigheten av å bruke en passende MOI. Videre kan det være vanskelig å hente fast tilhengerceller ved løsrivelse, noe som kan føre til en partisk representasjon av visse makrofager undergrupper som brukes til strømningscytometrianalyser. Et avgjørende skritt i flytcytometrianalyse innebærer riktig bruk av perler kompensasjon matrise og negative kontroller som unstained celler eller FMO (Fluorescence Minus One) kontroller for å sikre riktig manuell gating.
En annen begrensning innebærer polarisering av monocytter avledet fra blod og ikke fra det lokale vevsmiljøet. Kjennetegnet på menneskelig TB er dannelse av granulomer i Mtb-infisert vev, og dermed bør immunopaologi i TB fortrinnsvis studeres på det lokale vevsstedet. Monocytter rekrutteres imidlertid til lungen fra perifert blod ved betennelse/infeksjon, hvor celler kan skille seg ut i makrofager i nærvær av inflammatoriske cytokiner som GM-CSF12. Viktig, i det fysiologiske miljøet av vev in vivo, er det sannsynligvis en stor heterogenitet av makrofag polarisering inkludert en blanding og forskjellige forhold mellom forskjellige M1- og M2-lignende makrofagpopulasjoner som bidrar til skjebnen til TB-infeksjon36. Vi har tidligere utviklet en human organotypisk lungevevsmodell som muliggjør 3D-studier av makrofagmediert granulomdannelse i TB37. Det kan være interessant å utnytte den nåværende M1/M2 polariseringsprotokollen i kombinasjon med lungevevsmodellen for å studere TB granulomdannelse, effektorfunksjoner og M1/M2-forhold i eksperimentelt vev.
Denne M1/M2 flowcytometriprotokollen kan lett tilpasses for å inkludere et utvidet panel av myeloidmarkører som er nyttige for vurdering av funksjoner forbundet med hemmende så vel som inflammatoriske responser. Det er stor forskningsinteresse i hemmende immunkontrollpunktmolekyler som PD-1, SIRP-α, IDO og arginaser som kan modulere makrofagresponser38. I denne sammenhengen kan polarisering av myeloide celler også innebære andre stimuli som fremmer immunregulatoriske makrofager (Mreg) eller myeloid-avledede undertrykkerceller (MDSC) som har vist seg å være involvert i flere sykdommer, inkludert TB38. Mer avanserte strømningscytometripaneler av M1/M2/Mreg-makrofagundergrupper kan også omfatte intracellulær farging av cytokiner/kjemokiner IL-1β, TNF-α, IL-10 og MCP-1 eller andre løselige faktorer eller effektormolekyler som induserbart nitrogenoksid (iNOS) og antimikrobielle peptider. Dette kan forbedre mulighetene for å studere polyfunksjonelle makrofagresponser, på samme måte som det som er grundig beskrevet for T-celler39.
For tiden kan strømningscytometrifargingspaneler inkludere opptil 30-40 farger, noe som gir muligheten til å immunofenotype flere celleundergrupper og molekyler samtidig. Det grunnleggende eksperimentelle oppsettet av denne M1/M2 flowcytometriprotokollen kan brukes som en ryggrad som er kompatibel med de fleste gamle så vel som nye strømningscytometere og kan bygges på og skreddersys i henhold til individuelle behov, inkludert utfordringene ved arbeid med virulente Mtb i et BSL-3-miljø. I dag er dimensjonalitetsreduksjonsteknikker som UMAP tilgjengelige i de nye versjonene av flowcytometriprogramvare, som muliggjør analyse av et stort antall parametere generert i encellede studier som er avgjørende for forbedret visualisering og tolkning av høydimensjonale data40. De konstante teknologiske forbedringene i strømningscytometri vil sannsynligvis fortsette i de kommende årene, inkludert kombinasjonen av multiparametrisk fenotyping sammen med moderne cellesorteringsevner, der denne protokollen kan være nyttig i flere makrofagbaserte Mtb-infeksjonsanalyser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker våre kolleger i Folkehelseinstituttet i Sverige, Matilda Svensson og Solomon Ghebremichael for hjelp i BSL-3-laboratoriet.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Swedish Heart and Lung Foundation (HLF) (2019-0299 og 2019-0302 til SB), Det svenske forskningsrådet (VR) (2014-02592, 2019-01744 og 2019-04720 til SB), Stiftelsen for å forhindre antibiotikaresistens (Resist), Karolinska Institutet Foundations og KID til SB (delvis finansiering av doktorgradsutdanning for Marco Loreti) fra Karolinska Institutet. ML ble støttet fra Den svenske barnekreftstiftelsen (TJ2018-0128 og PR2019-0100).
8-well chamber slides | Lab-Tek | 154534 | |
BD Comp bead plus | BD | 560497 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
DAPI Mounting media | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
EDTA (0.5 M) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Falcon 6-well Flat Bottom plates | Corning Life Sciences | 353046 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycerol (70%) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | R37121 | Secondary antibody for CD64 |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Secondary antibody for CD163 |
HEPES | GE Healthcare Life Sciences | SH30237.01 | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
IL-4 | Peprotech | 200-04 | |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences | SH30034.01 | |
LPS (Escherichia coli O55:B5) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 11508545 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Middle Brook 7H10 agar plates | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Middle Brook 7H9 media | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Mouse anti-human CD64 primary antibody | Bio-Rad | MCA756G | Clone: 10.1 |
Na-pyruvate | GE Healthcare Life Sciences | SH300239.01 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Rabbit anti-human CD163 primary antibody | GeneTex | GTX81526 | Polyclonal |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | SH30096.01 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
TubeSpin bioreactor tubes | TPP Techno Plastic Products AG | 87050 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |