Detta protokoll ger en metod för att studera Mycobacterium tuberkulos infektion i mänskliga M1- eller M2-polariserade makrofager baserat på differentiering av perifert blod-monocyter till makrofagliknande celler som är infekterade med GFP-märkta virulent stam H37Rv, och analyseras med flöde cytometri med hjälp av en 10-färg panel inklusive uttryck av utvalda M1/M2 markörer.
Mänskliga makrofager är primära värdceller av intracellulära Mycobacterium tuberkulos (Mtb) infektion och har därmed en central roll i immun kontroll av tuberkulos (TB). Vi har upprättat ett experimentellt protokoll för att följa immunpolarisering av myeloisk-härledda celler till M1 (klassiskt aktiverad) eller M2 (alternativt aktiverad) makrofagliknande celler genom bedömning med en 10-färgs flöde cytometri panel som möjliggör visualisering och djup karakterisering av grön-fluorescerande protein (GFP)-märkt Mtb i olika makrofager delmängder. Monocyter som erhållits från friska blodgivare polariserades till M1- eller M2-celler med hjälp av differentiering med granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) eller makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) följt av polarisering med IFN- γ respektive lipopolysackarid (LPS) respektive IL-4. Fullständigt polariserade M1- och M2-celler smittades med Mtb-GFP i 4 timmar innan fristående Mtb-infekterade makrofager färgades med flöde cytometri vid 4- eller 24-timmars post-infektion. Provförvärv utfördes med flödescytometri och data analyserades med hjälp av en programvara för flödescytometrianalys. Manuell gating samt dimensionalitet minskning med enhetlig grenrör approximation och projektion (UMAP) och fenograf analys utfördes. Detta protokoll resulterade i effektiv M1/M2 polarisering kännetecknas av förhöjda nivåer av CD64, CD86, TLR2, HLA-DR och CCR7 på oinfekterade M1 celler, medan oinfekterade M2 celler uppvisade en stark uppreglering av M2 fenotyp markörer CD163, CD200R, CD206 och CD80. M1-polariserade celler innehöll vanligtvis färre bakterier jämfört med M2-polariserade celler. Flera M1/M2 markörer var downregulated efter Mtb infektion, vilket tyder på att Mtb kan modulera makrofag polarisering. Dessutom konstaterades 24 olika cellkluster av olika storlekar vara unikt fördelade mellan M1 och M2 oinfekterade och Mtb-infekterade celler vid 24-timmars post-infektion. Detta M1/M2 flöde cytometri protokoll kan användas som ryggrad i Mtb-makrofag forskning och antas för särskilda behov inom olika forskningsområden.
Makrofager är immunceller som bidrar avsevärt till regleringen av vävnad homeostas, inflammation, och sjukdom patologier. Som en viktig komponent i medfödd immunitet uttrycker cellernas monocyt-makrofag härstamning heterogena fenotyper som svar på ändrade miljösignaler, som återspeglar deras plasticitet och anpassning till olika anatomiska och immunologiska platser1. Beroende på tillväxtfaktorerna cytokiner och andra medlare som finns i mikromiljön, makrofager har kategoriserats i två stora reversibla populationer, var och en med en annan roll i bakteriell kontroll och clearance2:proinflammatoriska, klassiskt aktiverade M1-polariserade makrofager och antiinflammatoriska, alternativt aktiverade M2-polariserade makrofager som ursprungligen namngavs för att efterlikna T-hjälpare (Th) cellnomenklatur3. Denna gruppering av immunpolariserade makrofager anses ofta förenklad, eftersom makrofagaktivering och differentiering inte är linjär, men mer exakt illustrerad som ett kontinuum där varje befolkning har olika egenskaper och funktionella roller i resultatet av sjukdomsutveckling och progression4,5,6,7. Ändå finns det många experimentella fördelar med makrofagmodellen M1/M2 som kan användas inom flera olika forskningsområden.
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) är orsaksmedlet för tuberkulos (TB) och har uppskattats infektera en person varje sekund och anses vara det mest dödliga enskilda smittämnet i världen (Global TB-rapport 2019). Eftersom luftvägarna är huvudvägen för Mtb-infektion är alveolära makrofager de föredragna värdcellerna som ska infekteras med Mtb och representerar både de primära barriärerna och den smittsamma reservoaren för Mtb i lungorna. Makrofagpolarisering som svar på olika stimuli har studerats utförligt underåren 7 och i de flesta av de publicerade verken, M1 polarisering av monocyt kulturer in vitro induceras av Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) tillsammans med IFN-γ och LPS8,9, medan M2 polarisering induceras med makrofag koloni stimulerande faktor (M-CSF) och IL-410,11. M1-makrofager är potenta effektorceller som förmedlar antimikrobiella svar mot intracellulära patogener och har en viktig roll i antitumörimmunitet12. M2 makrofager, å andra sidan, har en antiinflammatorisk funktion, hög fagocytisk kapacitet och är främst involverade i sårläkning och vävnadsreparation samt i parasitinfektioner12. M1-makrofager anses därför vara effektivare vid intracellulär kontroll av Mtb jämfört med M2-makrofager13. Men Mtb-bakterier har också potential att modulera makrofagpolarisering för att undergräva medfödd immunitet14,15,16,17.
Medan det är vanligt att generera makrofager från differentiering av monocyter som erhållits från perifertblod 18,kan makrofager också genereras från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)19 eller från benmärgs-härledda makrofager från möss20,21. Dessa är genomförbara tekniker för att studera primära makrofagceller som erhållits från monocyt/makrofag stamceller som kommer att föröka sig och differentiera till en homogen population av mogna makrofag-liknande celler. Dessa protokoll ger dock sällan fördjupad kunskap om fenotyp och funktion hos de erhållna cellerna eller redovisar den naturliga heterogenitet som observerats bland makrofager som erhållits in vivo. Eftersom Mtb är en strikt mänsklig patogen finns det också en fördel att studera Mtb i humaniserade modellsystem. Flödescytometri är en kraftfull teknik som erbjuder möjligheten att bedöma flera fenotypiska och funktionella egenskaper hos enstaka celler i suspension22, något som kan vara ganska utmanande med vidhäftande celler som makrofager som också är kända för att vara autofluorescerande23,24. Förutom kemisk avlossning av fast vidhäftande makrofager kan Mtb-infektion utgöra en betydande stressfaktor för cellerna som lägger till en annan nivå av komplexitet i flödescytometriska analyser av Mtb-infekterade makrofager.
I detta experimentella protokoll har vi använt en tidigare etablerad human makrofag infektion modell baserat på immun polarisering av primära perifera-blod-monocyt-härledda celler som är infekterade med virulent laboratorium Mtb stam H37Rv, och analyseras med flöde cytometri med hjälp av en 10-färg panel inklusive uttryck av utvalda M1 och M2markörer 25. Detta protokoll ger en effektiv och reproducerbar metod för att studera svar på Mtb infektion i M1 eller M2 polariserade monocyt-härledda makrofager. Dessutom tillåter användningen av flödescytometri på vidhäftande Mtb-infekterade makrofager oss att studera en mängd olika ytmarkörer associerade med konventionella M1- och M2-makrofager och deras longitudinella svar på Mtb-infektion. Viktigt är att detta protokoll lätt kan antas för undersökningar av infektioner med andra patogener, i antitumörstudier eller i studier av inflammatoriska tillstånd, för läkemedelsscreening etc. och kan också utnyttjas för bedömning av M1/M2 makrofagpolarisering i kliniska prover hos människa.
Detta experimentella protokoll beskriver effektiv polarisering av myeloisk-härledda celler till M1 eller M2 fenotyper inklusive bedömning med en 10-färg flöde cytometri panel som tillåter visualisering och djup karakterisering av GFP-märkta Mtb i olika makrofager delmängder. Även om TB är en gammal mänsklig sjukdom, finns det för närvarande ingen gyllene standardmodell för att studera Mtb-makrofag interaktioner, och flerfärgsflöde cytometri av makrofager kan vara komplicerat jämfört med analyser av lymfocyt svar. Få tillgängliga protokoll för in vitro-differentiering av mänskliga monocyter till makrofager ger djup kunskap om vilken typ av makrofager som genereras. Ett grundläggande protokoll för makrofagpolarisering och flödescytometrisk bedömning av makrofagaktivering med hjälp av en solid panel av markörer kan sannolikt underlätta sådan karakterisering och erbjuda möjligheter att utforska ytterligare funktioner i polariserade celler som behandlas under olika förhållanden. Detta inbegriper analyser av celler odlade in vitro samt analyser av celler in vivo i kliniska prover, dvs. både PBMC och encelliga suspensioner från kroppsvätskor (dvs. bronkolalveolär lavage) eller homogeniserad vävnad. Differentiering och/eller aktiveringsstatus för monocyter och makrofager från patienter kan därför vara relaterade till sjukdomsutfall. Expansion av CD16+CD163+ monocyter i perifert blod har rapporterats hos lung TB patienter30. En ökad frekvens av CD163+ celler upptäcktes också i den inflammerade huden hos atopisk dermatit patienter31. På samma sätt har CD206+ M2-liknande makrofager visat sig hämma spridning och differentiering av celler i mikromiljön av adipocytvävnad32 och berikas i benmärgsprover från patienter med akut myeloisk leukemi (AML)29. Ett förhöjt förhållande mellan CD64 (M1) och CD163 (M2) celler i helblod av patienter med artros konstaterades vara associerad med sjukdomens svårighetsgrad33. En annan studie använde CD86 (M1) och CD163 (M2) för att visa att höga M1 uttryck i vävnad korrelerade till sämre resultat i en undergrupp av maligna hjärntumörer34.
Det finns flera betydande fördelar med detta experimentella M1/M2 flöde cytometri protokoll. Denna modell ger möjlighet att studera medfödda immunsvar på virulent Mtb-infektion och kan utvecklas för att innehålla studier av adaptiva immunsvar genom att lägga till autologa T-celler tillsammans med M1- eller M2-makrofager vid blandade lymfocytreaktioner (MLR). Protokollet är också lämpligt för läkemedelsscreening och testning av olika immunmodulerande och antimikrobiella föreningar. Här har vi tidigare studerat effekterna av D-vitamin och histondeacetylashämmaren fenylbutyrat på myeloisk-härledda celler efter Mtb-infektion25,35. M1/M2 flöde cytometri kan också användas för att bedöma makrofat aktivering efter konditionering med cell kultur supernatants eller patientens plasma. Medan in vivo-studier av TB-saminfektion med HIV eller helminths eller TB- diabetes samsjuklighet kan vara utmanande, kan den mindre komplexa M1/ M2-modellen underlätta studier av samsjuklighet in vitro. På samma sätt kan protokollet utnyttjas för överföringsstudier för att undersöka cellernas Mtb-smittsamhet eller för att undersöka fagocytisk såväl som antigenpresentationskapacitet hos enskilda M1/M2-celler. M1/M2 flöde cytometri är också attraktivt för användning i biomarkör och vaccin studier, att följa sjukdom prognos under behandling och att testa terapier som riktar sig mot myeloisk-härledda celler. Viktigt är att ett antal olika metoder kan tillämpas parallellt med flödescytometri för samtidig bedömning av makrofagpolariseringsfenotyper och funktionella svar med konfokal mikroskopi (figur 3D), PCR i realtid, western blot, multiplex analyser och ELISA av lösliga faktorer i kulturen supernatant samt bedömning av intracellulär bakteriell smittsamhet och tillväxt med GFP-uttryck (flöde cytometri och confocal mikroskopi) och koloni bildas enheter (CFU). Infektion av M1- eller M2-celler med Mtb-GFP-bakterier möjliggör också sortering av de oinfekterade och Mtb-infekterade cellerna från samma prov för encellig RNA-sekvenseringsanalys.
Det beskrivna protokollet har också vissa begränsningar, inklusive både tekniska och vetenskapliga nackdelar. Nackdelen med monocyt-härledda makrofager från mänskliga blodgivare är att donatorvariationen ofta är hög och det faktum att cellerna inte polariseras i den fysiologiska miljön hos mänskliga vävnader. Stor variation i M1/M2 polariseringseffekt eller Mtb-smittsamhet mellan givare kan leda till problem med både intra- och interexperimentala variationer, låg statistisk effekt och ett behov av att inkludera många givare för att få tillförlitliga resultat. Dessutom resulterar plast vidhäftning av monocyter från PBMCs i ett givarberoende antal monocyter/brunn som så småningom kan ge en godtycklig MOI som kan påverka makrofag polarisering och cell livskraft efter Mtb infektion. Kritiska steg i protokollet innebär korrekt tvättning för att förhindra att andra celltyper förorenar cellkulturerna som också kan påverka makrofagpolariseringen. Medan en för låg MOI kan efterlikna latent TB-infektion, kommer en för hög MOI att döda cellerna, vilket belyser vikten av att använda en lämplig MOI. Dessutom kan det vara svårt att hämta fast vidhäftande celler vid lossning, vilket kan resultera i en partisk representation av vissa makrofager delmängder som används för flöde cytometri analyser. Ett avgörande steg i flödescytometrianalysen innebär korrekt användning av pärlor kompensationsmatris och negativa kontroller såsom osedda celler eller FMO (Fluorescence Minus One) kontroller för att säkerställa korrekt manuell gating.
En annan begränsning innebär polarisering av monocyter som härrör från blod och inte från den lokala vävnadsmiljön. Kännetecknet för mänsklig tbc är bildandet av granulom i Mtb-infekterade vävnader och därför bör immunopathology i TB företrädesvis studeras på den lokala vävnadsplatsen. Monocyter rekryteras dock till lungan från perifert blod vid inflammation/infektion, där celler kan differentiera sig i makrofager i närvaro av inflammatoriska cytokiner som GM-CSF12. Viktigt, i den fysiologiska miljön av vävnad in vivo, det finns sannolikt en stor heterogenitet av makrofag polarisering inklusive en blandning och olika förhållanden av olika M1- och M2-liknande makrofag populationer som bidrar till ödet för TB infektion36. Vi har tidigare utvecklat en human organotypisk lungvävnadsmodell som möjliggör 3D-studier av makrofagmedierad granulombildning i TB37. Det kan vara intressant att utnyttja det nuvarande M1/M2 polarisering protokollet i kombination med lungvävnadsmodellen för att ytterligare studera TB granulom bildas, effector funktioner och M1/M2 förhållandet i experimentell vävnad.
Detta M1/M2 flödecytometry protokoll kan lätt anpassas för att inkludera en utökad panel av myeloiska markörer som är användbara för bedömning av funktioner som är associerade med hämmande såväl som inflammatoriska svar. Det finns ett stort forskningsintresse för hämmande immunkontrollmolekyler som PD-1, SIRP-α, IDO och arginaser som kan modulera makrofagsvar38. I detta sammanhang kan polarisering av myeloiska celler också innebära andra stimuli som främjar immunregulatoriska makrofager (Mreg) eller myeloisk-härledda suppressorceller (MDSC) som har visat sig vara inblandade i flera sjukdomar inklusive TB38. Mer avancerade flöde cytometri paneler av M1/M2/Mreg makrofag delmängder kan också omfatta intracellulär färgning av cytokiner/chemokiner IL-1β, TNF-α, IL-10 och MCP-1 eller andra lösliga faktorer eller effektor molekyler såsom inducible kväveoxid (iNOS) och antimikrobiella peptider. Detta kan förbättra möjligheterna att studera polyfunktionella makrofag svar, liknande vad som har beskrivits utförligt för T celler39.
För närvarande kan flöde cytometri färgning paneler innehålla upp till 30-40 färger, vilket ger möjlighet att immunophenotype flera cell delmängder och molekyler samtidigt. Den grundläggande experimentella uppsättningen av detta M1/M2 flöde cytometri protokoll kan användas som en ryggrad som är kompatibel med de flesta gamla samt nya flöde cytometrar och kan byggas på och skräddarsys enligt individuella behov inklusive de utmaningar som arbetet med virulent Mtb i en BSL-3-miljö innebär. Numera finns dimensionalitetsreduktionstekniker som UMAP tillgängliga i de nya versionerna av flödescytometriprogramvara, vilket möjliggör analys av ett stort antal parametrar som genereras i encelliga studier som är avgörande för förbättrad visualisering och tolkning av högdimensionella data40. De ständiga tekniska förbättringarna i flöde cytometri kommer sannolikt att fortsätta under de kommande åren inklusive kombinationen av multi-parametrisk fenotypning tillsammans med moderna cell sortering kapacitet, där detta protokoll kan visa sig användbart i flera makrofag baserade Mtb infektion analyser.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar våra kollegor på Folkhälsomyndigheten, Matilda Svensson och Solomon Ghebremichael för hjälp i BSL-3-laboratoriet.
Detta arbete stöddes av anslag från Hjärt- och Lungfonden (HLF) (2019-0299 och 2019-0302 till SB), Vetenskapsrådet (VR) (2014-02592, 2019-01744 och 2019-04720 till SB), Stiftelsen för förebyggande av antibiotikaresistens (Resist), Karolinska Institutets stiftelser och KID to SB (partiell finansiering av forskarutbildning för Marco Loreti) från Karolinska Institutet. ML fick stöd från Barncancerfonden (TJ2018-0128 och PR2019-0100).
8-well chamber slides | Lab-Tek | 154534 | |
BD Comp bead plus | BD | 560497 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
DAPI Mounting media | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
EDTA (0.5 M) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Falcon 6-well Flat Bottom plates | Corning Life Sciences | 353046 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycerol (70%) | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | R37121 | Secondary antibody for CD64 |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Secondary antibody for CD163 |
HEPES | GE Healthcare Life Sciences | SH30237.01 | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
IL-4 | Peprotech | 200-04 | |
L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences | SH30034.01 | |
LPS (Escherichia coli O55:B5) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 11508545 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Middle Brook 7H10 agar plates | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Middle Brook 7H9 media | Karolinska University hospital, Huddinge | N/A | |
Mouse anti-human CD64 primary antibody | Bio-Rad | MCA756G | Clone: 10.1 |
Na-pyruvate | GE Healthcare Life Sciences | SH300239.01 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Rabbit anti-human CD163 primary antibody | GeneTex | GTX81526 | Polyclonal |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | SH30096.01 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
TubeSpin bioreactor tubes | TPP Techno Plastic Products AG | 87050 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich | P4780 |