3D-odling av organoider från intestinala Villi Epitel som genomgår dedifferentiering
Summary
Förfarandet beskriver isolering av villi från mus intestinala epitel genomgår dedifferentiering för att bestämma deras organoid formning potential.
Abstract
Clonogenicity av organoider från intestinala epitel tillskrivs förekomsten av stamceller däri. Musens lilla intestinala epitel är indelat i krypter och villi: stammen och prolifererande celler är begränsade till krypterna, medan villi epitel innehåller endast differentierade celler. Därför kan de normala tarmkrypterna, men inte villi, ge upphov till organoider i 3D-kulturer. Förfarandet som beskrivs här är endast tillämpligt på villus epitel som genomgår dedifferentiering som leder till stemness. Metoden som beskrivs använder Smad4-förlust-av-funktion:β-catenin gain-of-function (Smad4KO:β-cateninGOF)villkorlig mutant mus. Mutationen gör att tarm villi dedifferentierar och genererar stamceller i villi. Intestinala villi som genomgår dedifferentiering skrapas av tarmarna med hjälp av glasrutschbanor, placeras i en 70 μm sil och tvättas flera gånger för att filtrera bort lösa celler eller krypter före plätering i BME-R1 matris för att bestämma deras organoidbildande potential. Två huvudkriterier användes för att säkerställa att de resulterande organoiderna utvecklades från det dedifferentierande villusfacket och inte från krypterna: 1) mikroskopiskt utvärdera den isolerade villi för att säkerställa frånvaron av några tjudrade krypter, både före och efter plätering i 3D-matrisen och 2) övervakning av tidsföringen för organoid utveckling från villi. Organoid initiering från villi förekommer endast två till fem dagar efter plätering och verkar oregelbundet formad, medan krypt-härledda organoider från samma intestinala epitel är uppenbara inom sexton timmar efter plätering och verkar sfäriska. Begränsningen av metoden är dock att antalet organoider som bildas och den tid som krävs för organoidinitiering från villi varierar beroende på graden av dedifferentiering. Beroende på mutationens specificitet eller förolämpningen som orsakar dedifferentieringen måste därför det optimala stadiet där villi kan skördas för att analysera deras organoida formningspotential bestämmas empiriskt.
Introduction
Tarmkrypterna men inte villi, bildar organoider när de odlas i Matrigel eller BME-R1 matris. Dessa organoider är självorganiserande strukturer, ofta kallade “mini-gut” på grund av närvaron av de olika differentierade härstamningar, stamceller och stamceller som finns i tarmepiteleriet in vivo. Potentialen att bilda organoider från krypter tillskrivs närvaron av stamceller1. Intestinala villi består å andra sidan endast av differentierade celler och kan därför inte bilda organoider. Mutationer2 eller tillstånd som tillåter dedifferentiering av villus epitel kan dock leda till stamceller i villi2,3. Denna ödesförändring som resulterar i stemness i villi epitel kan bekräftas genom plätering av dedifferentiering villus epitel i 3D matris för att bestämma deras organoid-formning potential som en indikator på de-novo stemness i villus epitel. Därför är den kritiska aspekten av detta förfarande att säkerställa frånvaro av kryptförorening.
Smad4KO:β-cateninGOF villkorlig mutation orsakar dedifferentiering i intestinala epitel som kännetecknas av uttryck av spridning och stamcellsmarkörer i villi, och så småningom bildandet av kryptliknande strukturer i villi som kallas ectopic krypter Förekomsten av stamceller dessa dedifferentierade villi bestämdes av uttrycket av stamcellsmarkörer i ectopic krypter (in vivo) och mutant villis förmåga att bilda organoider wh pläterad Matrigel3. Nedan nämnda förfarande utarbetar den metod som används för att bekräfta stemnessen hos det dedifferentierande intestinala epitelet i Smad4KO:β-cateninGOF mutanta möss. Ett viktigt inslag i denna metod för att isolera villi var användningen av skrapning av tarmlumen, i motsats till EDTA-kelatmetoden4. Till skillnad från i EDTA-kelatmetoden behåller villi-isoleringen genom att skrapa majoriteten av det underliggande mesenchymet och gör det möjligt att justera trycket på skrapning för att ge villi utan tjudrade krypter. Skraptrycket är subjektivt för operatören, därför måste det optimala trycket för att ge villi utan krypter fastbundet bestämmas empiriskt av operatören. Den kritiska aspekten av detta förfarande är att säkerställa frånvaron av kryptförorening genom mikroskopisk undersökning av villi både före och efter plätering i BME-R1 matrisen.
Intestinal villi skrapas bort från tarmlumen med glasrutschbanor och placeras i ett 70 μm-filter och tvättas med PBS för att bli av med lösa celler eller eventuella krypter innan de pläteras i BME-R1-matrisen. Metoden betonar följande kriterier för att undvika kryptkontaminering: a) begränsa villi-skörden av den proximala halvan av årondenum där villi är längst, b) minimera antalet villi-avgivande skrapsår, c) tvätta filtret som innehåller villi genom en serie PBS i en sex-brunns skål och d) bekräfta frånvaron av kryptkontaminering genom mikroskopisk undersökning före och efter plätering i BME-R1 matris. Villi isolering genom att skrapa, snarare än genom EDTA chelation, förhindrar fullständig förlust av den underliggande mesenchyme som kan genischsignalerna 5,6,7,8, om det behövs, för organoid initiering från villus epitel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod kan bekräfta självförnyelsekapaciteten hos dedifferentiering av villi epitel som förvärvar stamcellsmarkörer in vivo. Det normala intestinala epitelet kan ge upphov till organoider från kryptan men inte villi-facket, när det odlas i 3D på grund av närvaron av stamceller i krypterna1. Således bekräftar organoidbildning från det dedifferentierade villi epitel odlat i 3D-kulturer stamcellsbildning från cellens ödesåtervändning. Rapporter om cell öde återföring…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna publikation stöddes av Award Number K22 CA218462-03 från NIH National Cancer Institute. HEK293-T-cellerna som uttryckte R-Spondin1 var en generös gåva från Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
