3D Dyrkning af organoider fra Intestinal Villi Epithelium under dedifferentiation
Summary
Proceduren beskriver isolering af villi fra musen tarm epitel under dedifferentiation at bestemme deres organoid danner potentiale.
Abstract
Clonogenicitet af organoider fra tarmepilem tilskrives tilstedeværelsen af stamceller deri. Musens lille tarmepilem er opdelt i krypter og villi: stammen og de spredte celler er begrænset til krypterne, mens villi epitelet kun indeholder differentierede celler. Derfor kan de normale tarmkrypter, men ikke villi, give anledning til organoider i 3D-kulturer. Den procedure, der er beskrevet her, gælder kun for villus epitel under dedifferentiation, der fører til dængle. Den beskrevne metode anvender Smad4-tab-af-funktion:β-catenin gain-of-funktion (Smad4KO:β-cateninGOF)betinget mutant mus. Mutationen får tarm villi til at dedifferentiate og generere stamceller i villi. Intestinal villi under dedifferentiation skrabes af tarmen ved hjælp af glas dias, placeret i en 70 μm si og vaskes flere gange for at filtrere eventuelle løse celler eller krypter før plating i BME-R1 matrix til at bestemme deres organoid-dannende potentiale. To hovedkriterier blev anvendt for at sikre, at de resulterende organoider blev udviklet fra dedifferentierende villus-rum og ikke fra krypterne: 1) mikroskopisk evaluering af den isolerede villi for at sikre fravær af tøjrede krypter, både før og efter plating i 3D-matrixen, og 2) overvågning af tidspunktet for organoidudvikling fra villi. Organoid indledning fra villi forekommer kun to til fem dage efter plating og vises uregelmæssigt formet, mens krypt-afledte organoider fra samme intestinale epitel er synlige inden for seksten timer efter plating og synes sfærisk. Begrænsningen af metoden er imidlertid, at antallet af organoider dannet, og den tid, der kræves for organoid indledning fra villi varierer afhængigt af graden af dedifferentiation. Afhængigt af mutationens specificitet eller den fornærmelse, der forårsager dedifferentiationen, skal det optimale stadium, hvor villi kan høstes for at analysere deres organoiddannende potentiale, derfor bestemmes empirisk.
Introduction
Tarmklypterne, men ikke villi, danner organoider, når de dyrkes i Matrigel eller BME-R1 matrix. Disse organoider er selvorganiserende strukturer, ofte omtalt som “mini-gut” på grund af tilstedeværelsen af de forskellige differentierede slægter, stamfader og stamceller, der er til stede i tarmepilet in vivo. Potentialet til at danne organoider fra krypter tilskrivestilstedeværelsenaf stamceller 1 . Tarm villi på den anden side består kun af differentierede celler, og kan derfor ikke danne organoider. Mutationer2 eller tilstande, der tillader dedifferentiation af villus epitel, kan dog føre til stamceller i villi2,3. Denne skæbneændring, der resulterer i dængle i villi epitelet, kan bekræftes ved at plating den dedifferentierende villus epitel i 3D-matrix for at bestemme deres organoiddannende potentiale som en indikator for de-novo stilk i villus epitel. Derfor er det kritiske aspekt af denne procedure at sikre fravær af kryptforurening.
Smad4KO:β-cateninGOF betingede mutation forårsager dedifferentiation i tarmepilet, der er præget af udtrykket spredning og stamcellemarkører i villien, og til sidst dannelsen af kryptlignende strukturer i villi kaldet ektopiske krypter Tilstedeværelsen af stamceller disse dedifferentierede villi blev bestemt af ekspressionen af stamceller markører i de ektopiske krypter (in vivo) og mutant villiens evne til at danne organoider wh en forgyldt Matrigel3. Nedenstående procedure uddyber den metode, der anvendes til at bekræfte stammen af det dedifferentierende tarmepilet i Smad4KO: β-cateninGOF mutantmus. Et centralt element i denne metode til isolering af villi var brugen af skrabning af tarm lumen, i modsætning til EDTA kelation metode4. I modsætning til EDTA-kelationsmetoden bevarer villi isolation ved skrabning størstedelen af det underliggende mesenchyme og gør det muligt at justere skrabetrykket for at give villi uden tøjrede krypter. Skrabningens tryk er subjektivt for operatøren, og derfor skal det optimale tryk for at give villi uden krypter bundet bestemmes empirisk af operatøren. Det afgørende ved denne procedure er at sikre, at der ikke er tale om kryptforurening ved mikroskopisk undersøgelse af villien både før og efter plating i BME-R1-matrixen.
Intestinal villi skrabes af tarm lumen med glas dias og placeres i en 70 μm filter og vaskes med PBS at slippe af med løse celler eller krypter, hvis nogen, før plating i BME-R1 matrix. Metoden understreger følgende kriterier for at undgå kryptforurening: a) begrænsning af villihøsten den proksimale halvdel af duodenum, hvor villien er længst, b) minimering af antallet af villi-givende skrammer, c) vask af filteret, der indeholder villi gennem en række PBS i en seks-brønds skål, og d) bekræfter fraværet af kryptforurening ved mikroskopisk undersøgelse før og efter plating i BME-R1 matrix. Villi isolation ved skrabning, snarere end ved EDTA kelation, forhindrer det fuldstændige tab af den underliggende mesenchyme, der kan give nichesignaler5,6,7,8, hvis det kræves, for organoid indledning fra villus epitel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metode kan bekræfte selvfornyelseskapaciteten ved at dedifferentiere villi epitelium, der erhverver stamcellemarkører in vivo. Den normale intestinale epitel kan give anledning til organoider fra krypten, men ikke villi-rummet, når det dyrkes i 3D på grund af tilstedeværelsen af stamceller i krypterne1. Således bekræfter organoid dannelse fra dedifferentiated villi epitel dyrkes i 3D-kulturer stamcelledannelse fra celle skæbne vending. Rapporter om omvendt celle skæbne i ta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne publikation blev støttet af Award Number K22 CA218462-03 fra NIH National Cancer Institute. HEK293-T-cellerne, der udtrykte R-Spondin1, var en generøs gave fra Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
