طريقة بسيطة للقطع الجاف للحصول على قسم الراتنج الكامل الحجم للبذر وتطبيقاته
Summary
هذه التقنية تسمح لإعداد سريع وبسيط من قسم الراتنج كامل الحجم البذور لمراقبة وتحليل الخلايا، وحبيبات النشا، والهيئات البروتين في مناطق مختلفة من البذور.
Abstract
المورفولوجيا، وحجم وكمية من الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في البذور تحديد وزن ونوعية البذور. وهي تختلف اختلافا كبيرا بين مناطق مختلفة من البذور. من أجل عرض morphologies من الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتين بوضوح ، وتحليل كميا المعلمات المورفولوجيا بدقة ، وهناك حاجة إلى قسم البذور كلها الحجم. على الرغم من أن قسم البارافين بالبذور الكاملة يمكن أن يحقق في تراكم مواد التخزين في البذور ، إلا أنه من الصعب جدًا تحليل بارامترات المورفولوجيا للخلايا ومواد التخزين نظرًا لدقة منخفضة للقطعة السميكة. يحتوي قسم الراتنج الرقيق على دقة عالية ، ولكن طريقة تقسيم الراتنج الروتينية ليست مناسبة لإعداد القسم الكامل بحجم البذور من البذور الناضجة مع حجم كبير ومحتوى كبير من النشا. في هذه الدراسة، نقدم طريقة بسيطة للقطع الجاف لإعداد قسم الراتنج الكامل بحجم البذور. يمكن لهذه التقنية إعداد المقاطع الشاملة الحجمة للبذور الكاملة المتقاطعة والطولية من البذور النامية والناضجة والمبتوتة والمضمروسة في راتنج LR White ، حتى بالنسبة للبذور الكبيرة ذات المحتوى العالي من النشا. يمكن أن يكون مقطع كامل بحجم البذور ملطخة مع الفلورسنت 28، اليود، وCoomassie الأزرق الرائع R250 ليعرض على وجه التحديد مورفولوجيا الخلايا وحبيبات النشا، والهيئات البروتين بوضوح، على التوالي. ويمكن أيضا أن يتم تحليل الصورة التي تم الحصول عليها كميا لإظهار المعلمات مورفولوجيا الخلايا، وحبيبات النشا، والهيئات البروتين في مناطق مختلفة من البذور.
Introduction
تحتوي البذور النباتية على مواد تخزين مثل النشا والبروتين وتوفر الطاقة والتغذية للناس. يحدد شكل وحجم وكمية الخلايا ومواد التخزين وزن ونوعية البذور. الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور لها morphologies مختلفة بشكل ملحوظ، وخاصة بالنسبة لبعض المحاصيل الحبوب عالية amylose مع تثبيط النشا المتفرعة إنزيم IIb1،2،3. لذلك ، من المهم جدًا التحقق من الصفات المورفورة للخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور.
البارافين هو طريقة جيدة لإعداد الجزء الكامل البذور الحجم ويمكن أن يعرض هيكل الأنسجة من البذور وتراكم مواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور4،5،6. ومع ذلك، فإن أقسام البارافين عادة ما يكون 6-8 μm سمك مع دقة منخفضة؛ وبالتالي ، فمن الصعب جدا أن نلاحظ بوضوح وتحليل كمي مورفولوجيا من المواد الخلية والتخزين. أقسام الراتنج وعادة ما يكون 1-2 μm سمك ودقة عالية ومناسبة جدا لمراقبة وتحليل مورفولوجيا من مواد الخلية والتخزين7. ومع ذلك، فإن طريقة تقسيم الراتنجات الروتينية تواجه صعوبة في إعداد القسم الكامل بحجم البذور، وخاصة بالنسبة للبذور ذات الحجم الكبير والمحتوى العالي من النشا؛ وهكذا، لا توجد طريقة لمراقبة وتحليل مورفولوجيا الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور. LR الراتنج الأبيض هو راتنج الاكريليك والمعارض اللزوجة المنخفضة والنفاذية القوية، مما يؤدي إلى تطبيقاته جيدة في إعداد قسم الراتنج من البذور، وخاصة بالنسبة الحبوب الحبوب ناضجة حبات مع حجم كبير وارتفاع محتوى النشا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون ملطخة العينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج الأبيض LR بسهولة مع العديد من الأصباغ الكيميائية لعرض بوضوح مورفولوجيا من الخلايا ومواد التخزين تحت ضوء أو المجهر الفلورسنت7. في ورقتنا السابقة، أبلغنا عن طريقة اقسام جافة لإعداد الأجزاء الكاملة بحجم البذور من حبات الحبوب الناضجة المضمنة في راتنج LR White. ويمكن لهذه الطريقة أيضا إعداد الجزء الكامل من البذور الحجم من تطوير، والنباتة والمطبوخة نواة الحبوب8. تم الحصول على كامل البذور الحجم القسم لديها العديد من التطبيقات في مجال الرصد والتحليل micromorphology ، وخاصة بالنسبة للعرض بوضوح وتحليل كمي الاختلافات في مورفولوجيا الخلايا ومواد التخزين في مناطق مختلفة من البذور8،9.
هذه التقنية مناسبة للباحثين الذين يرغبون في مراقبة البنية المجهرية للأنسجة وشكل وحجم الخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور باستخدام المجهر الخفيف. يمكن تحليل صور الأجزاء الكاملة بحجم البذور الملطخة خصيصًا لثناء الخلايا المعرضة وحبيبات النشا والهيئات البروتينية بواسطة برنامج تحليل المورفولوجيا لقياس المعلمات المورفولوجية للخلايا وحبيبات النشا والهيئات البروتينية في مناطق مختلفة من البذور. من أجل إظهار التطبيق التقني وتطبيقات القسم الكامل الحجم بالبذور ، قمنا بالتحقيق في البذور الناضجة من الذرة والبذور النباتية والاغتصاب وزراعة ، والنبات ، والحبوب من الأرز المطبوخ في هذه الدراسة. يحتوي البروتوكول على أربع عمليات. هنا، ونحن نستخدم نواة الذرة الناضجة، والتي هي الأكثر صعوبة في إعداد أقسام البذور الحجم كله بسبب حجم كبير وارتفاع محتوى النشا، كعينة لعرض العمليات خطوة بخطوة.
Protocol
Representative Results
Discussion
والبذور هي أهم مورد متجدد للأغذية والأعلاف والمواد الخام الصناعية، وهي غنية بمواد التخزين مثل النشا والبروتين. المورفولوجيا وكمية الخلايا ومحتوى وتكوين مواد التخزين تؤثر على وزن ونوعية البذور7،12. على الرغم من أن تكنولوجيا علم المجسمات وتحليل الصور يمكن ق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية الصينية (32071927)، ومشروع المواهب في جامعة يانغتشو وتطوير البرنامج الأكاديمي ذات الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو.
Materials
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
- Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099 (2013).
- Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
- Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8 (2020).
- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
- Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
- Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
- Lott, J. N. A. Protein bodies in seeds. Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).
- Jing, Y. P., et al. Development of endosperm cells and starch granules in common wheat. Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).
