全種サイズ樹脂断面の簡易ドライ断面化方法とその応用
Summary
この技術は、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒およびタンパク質体の観察と分析のための全種サイズの樹脂セクションの迅速かつ簡単な調製を可能にする。
Abstract
種子中の細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態、大きさ、量は、種子の重量と品質を決定します。彼らは種子の異なる領域間で有意に異なっています。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態を明確に表示し、それらの形態パラメータを正確に定量的に分析するためには、全種サイズのセクションが必要です。全体の種子サイズのパラフィンセクションは、種子中の貯蔵材料の蓄積を調査することができますが、厚いセクションの低解像度のために細胞や貯蔵材料の形態パラメータを定量的に分析することは非常に困難です。薄い樹脂部は高解像度を有するが、日常的な樹脂切断法は、大きな容積および高デンプン含量の成熟した種子の全種サイズのセクションを調製するのに適していない。本研究では、全種サイズの樹脂部を作製するための簡単なドライ切片方法を紹介する。この技術は、高デンプン含有量を有する大きな種子であっても、LRホワイト樹脂に埋め込まれたクロスおよび縦方向の全種サイズのセクションを調製することができます。全種サイズのセクションは、蛍光増白剤28、ヨウ素、およびクーマシーブリリアントブルーR250で染色することができ、細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態をそれぞれ明確に示す。得られた画像を定量的に分析して、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態パラメータを示すこともできます。
Introduction
植物の種子は、デンプンやタンパク質などの貯蔵材料を含み、人々にエネルギーと栄養を提供します。セルと保管材料の形状、サイズ、および量によって、シードの重量と品質が決まります。種子の異なる領域の細胞および貯蔵材料は、特にデンプン分岐酵素IIb1、2、3の阻害を伴ういくつかの高アミロース穀物作物について、著しく異なる形態を有する。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を調べることは非常に重要である。
パラフィン切片は、種サイズのセクション全体を調製する良い方法であり、種子の組織構造と種子4、5、6の異なる領域における貯蔵材料の蓄積を示すことができる。しかし、パラフィンセクションは通常、低解像度で6〜8μmの厚さを有する。したがって、細胞や貯蔵材料の形態を明確に観察し、定量的に分析することは非常に困難です。樹脂のセクションは、通常、1〜2 μmの厚さと高分解能を有し、細胞および貯蔵材料7の形態を観察し、分析するのに非常に適している。しかし、日常的な樹脂切断法は、特に大量の澱粉含有量の高い種子に対して、シードサイズのセクション全体を準備するのが難しい。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を観察し、分析する方法はありません。LRホワイト樹脂はアクリル樹脂であり、低粘度と強い透過性を示し、種子の樹脂部分、特に大量および高デンプン含有量の穀物成熟したカーネルの準備に優れた用途につながります。また、LRホワイト樹脂に埋め込まれた試料は、多くの化学染料で容易に染色でき、光顕微鏡または蛍光顕微鏡7の下で細胞や貯蔵材料の形態を明瞭に示すことができる。前回の論文では、LRホワイト樹脂に埋め込まれた成熟したシリアルカーネルの全種サイズのセクションを調製するためのドライセパリング方法を報告しました。この方法はまた、開発、発芽および調理された穀物カーネル8の全種サイズのセクションを準備することができます。得られた全種サイズのセクションは、特に種子8,9の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態差を明確に観察し定量的に分析するための、微量形態の観察および分析において多くの用途を有する。
この技術は、組織の微細構造と細胞の形状と大きさ、デンプン顆粒、および異なる種子領域のタンパク質体を光学顕微鏡を用いて観察したい研究者に適しています。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体を示すために特別に染色された全種サイズのセクションの画像を形態解析ソフトウェアで解析し、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態パラメータを定量的に測定することができます。技術的な適用性と全種サイズのセクションアプリケーションを実証するために、我々は、トウモロコシと油糧種子菜種の成熟した種子と、この研究で米の開発、発芽、調理されたカーネルを調査しました。プロトコルには 4 つのプロセスが含まれています。ここでは、大量の澱粉含有量が多いためにシードサイズのセクション全体を準備する際に最も困難な成熟したトウモロコシカーネルを、工程を段階的に示すサンプルとして使用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
種子は、食品、飼料、工業原料のための最も重要な再生可能資源であり、デンプンやタンパク質などの貯蔵材料が豊富です。細胞の形態と量、および貯蔵材料の内容と構成は、種子7、12の重量と品質に影響を与えます。ステテロロジーと画像解析技術は、組織領域内の細胞のサイズと量を測定することができますが、多くの研究室に欠けています?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中国国立自然科学財団(32071927)、揚州大学の人材プロジェクト、江蘇高等教育機関の優先アカデミックプログラム開発によって資金提供されました。
Materials
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
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