Dna-analyser för miljön kräver rigorös design, testning, optimering och validering innan insamlingen av fältdata kan börja. Här presenterar vi ett protokoll för att ta användare genom varje steg för att utforma en artspecifik, sondbaserad qPCR-analys för detektion och kvantifiering av en målarts DNA från miljöprover.
Nya, icke-invasiva metoder för att upptäcka och övervaka artförekomst håller på att utvecklas för att stödja fiskeri- och viltvårdsförvaltningen. Användningen av eDNA-prover (Environmental DNA) för att upptäcka makrobiota är en sådan grupp metoder som snabbt blir populära och implementeras i nationella förvaltningsprogram. Här fokuserar vi på utveckling av artspecifika riktade analyser för sondbaserade kvantitativa PCR-applikationer (qPCR). Att använda sondbaserad qPCR erbjuder större specificitet än vad som är möjligt enbart med primers. Dessutom kan förmågan att kvantifiera mängden DNA i ett prov vara användbar för vår förståelse av eDNA:s ekologi och tolkningen av eDNA-detektionsmönster inom området. Det krävs noggranna överväganden vid utveckling och testning av dessa analyser för att säkerställa känsligheten och specificiteten hos att upptäcka målarten från ett miljöprov. I detta protokoll kommer vi att beskriva de steg som behövs för att utforma och testa sondbaserade analyser för detektion av en målart; inklusive skapande av sekvensdatabaser, analysdesign, val och optimering av analys, testanalysprestanda och fältvalidering. Att följa dessa steg kommer att bidra till att uppnå en effektiv, känslig och specifik analys som kan användas med förtroende. Vi demonstrerar denna process med vår analys utformad för populationer av mucket (Actinonaias ligamentina), en sötvattenmusselart som finns i Clinch River, USA.
Forskare och chefer blir alltmer intresserade av användningen av DNA-analyser för artdetektering. I tre decennier har kvantitativ pcr eller realtids PCR (qPCR/rtPCR) använts i många fält för sekvensspecifik detektion och kvantifiering av nukleinsyror1,2. Inom det relativt nya området eDNA-forskning har användningen av dessa analyser med en standardkurva för kvantifiering av kopior av mål-DNA per volym eller vikt av eDNA-provet nu blivit rutinpraxis. Mitokondriella DNA-sekvenser är i allmänhet riktade i eDNA-analyser eftersom mitokondriellt genom finns i tusentals kopior per cell, men analyser för nukleärt DNA eller RNA-sekvenser är också möjliga. Det är viktigt att förstå att publicerade analyser för eDNA-prover inte alltid är lika i prestanda. En analyss tillförlitlighet när det gäller att upptäcka endast DNA från en målart (dvs. specificitet) och detektion av låga mängder mål-DNA (dvs. känslighet) kan variera avsevärt på grund av skillnader i hur analysen utformades, valdes, optimerades och testades. Rapportering av kvantitativa mått på analysprestanda har tidigare till stor del förbisetts, men nyligen håller standarder för att förbättra transparensen i analysutvecklingenpå väg att växa fram 3,4,5,6,7,8.
Optimering och rapportering av analysprestandahjälpmedel vid studiedesign och tolkning av eDNA:s undersökningsresultat. Analyser som korsreagerar med DNA för icke-målarter kan leda till falska positiva upptäckter, medan analyser med dålig känslighet kan misslyckas med att upptäcka målartens DNA även när det finns i provet (falska negativ). En förståelse för analyskänslighet och selektivitet kommer att bidra till att informera de provtagningsinsatser som krävs för att upptäcka sällsynta arter. Eftersom det finns många naturliga variationskällor i eDNA måste studier begränsa kontrollerbara variationskällor så mycket som möjligt, inklusive fullständig optimering och karakterisering av eDNA-analysen3.
Förhållanden som direkt påverkar en analyss specificitet eller känslighet kommer att ändra analysens prestanda. Detta kan inträffa under olika laboratorieförhållanden (dvs. olika reagenser, användare, maskiner etc.). Detta protokoll bör därför ses över när en analys tillämpas under nya förhållanden. Även analyser som är väl karakteriserade i litteraturen bör testas och optimeras när de antas av ett nytt laboratorium eller när olika reagenser används (t.ex. mastermixlösning)5,9. Analysspecifikiteten kan ändras när den tillämpas på en annan geografisk region, eftersom analysen tillämpas på prover från en ny biotisk gemenskap som kan omfatta icke-målarter som analysen inte har testats mot, och genetisk variation i målarten kan förekomma. Återigen bör analysen ombedömds när den används på en ny plats. Fältförhållandena skiljer sig från laboratorieförhållandena eftersom PCR-hämmare på fältet är mer benägna att förekomma i prover. PCR-hämmare påverkar direkt förstärkningsreaktionen och påverkar därmed analysens prestanda. Därför krävs en intern positiv kontroll vid utveckling av en eDNA-analys.
Slutligen kan miljöförhållandena på fältet påverka målarternas DNA-molekyler och deras fångst genom DNA-nedbrytning, transport och retention. Dessutom varierar olika protokoll för DNA-insamling och extraktion i deras effektivitet och förmåga att behålla DNA. Det är dock viktigt att notera att dessa processer påverkar eDNA:s detekterbarhet men inte en molekylär analyss prestanda. Således är detekterbarhet av DNA från målarten i fältprover en funktion av både den tekniska prestandan hos qPCR-analysen samt fältförhållanden och insamlings-, lagrings- och extraktionsprotokoll. När du använder en väl karakteriserad och högpresterande analys kan användarna känna sig säkra på analysens kapacitet; göra det möjligt för forskare att nu fokusera på att förstå de externa analysfaktorerna (dvs. miljövariabler, skillnader i fångst- eller extraktionsprotokoll) som påverkar eDNA-detektion.
Här fokuserar vi specifikt på analysteknisk prestanda genom rigorös design och optimering. Vi demonstrerar protokollet med hjälp av en sondbaserad analys utvecklad för påvisande av en sötvattenmussla, mucket (Actinonaias ligamentina), från vatten som provtagits i Clinch River, USA. Nyligen presenterade Thalinger m.fl. (2020) riktlinjer för validering av riktade eDNA-analyser. Analysdesign enligt vårt protokoll kommer att ge en analys till Thalinger et al.s nivå 4 plus ett extra steg mot nivå 56. Vid denna tidpunkt kommer en analyss tekniska prestanda att optimeras och den kommer att vara klar för regelbunden användning i laboratorie- och fältapplikationer. Ytterligare användning av analysen i laboratorie-, mesokos- och fältexperiment kan sedan ta upp frågor om eDNA-detektion och faktorer som påverkar detekterbarheten, de sista stegen för validering på nivå5 6.
Som med alla studier är definitionen av den fråga som ska tas upp det första steget och utformningen av eDNA-analysen beror på studiens omfattning26. Om målet med forskningen eller undersökningen till exempel är att upptäcka en eller några arter är en riktad sondbaserad analys bäst. Om målet dock är att bedöma en större svit eller sammansättning av arter, är metabarkodningsanalyser med hög genomströmning bättre lämpade. När det har fastställts vilken metod som ska ske rekommenderas en pilotstudie med analysdesign, testning och optimering24. Analysdesignen börjar med en lista över arter som beskrivs i Figur 1. Denna förteckning kommer att ligga till grund för att förstå hur väl en analys fungerar när det gäller specificitet och det geografiska intervall som den kan tillämpas på6,10. Det uppmuntras att utforma analysen för ett visst geografiskt område, vilket gör det möjligt för konstruktören att bättre testa en analys för korsaktivitet mot andra arter i det området, och att vara medveten om de begränsningar detta har för att utvidga en analys till andra områden där en målart kan förekomma.24. När listan är klar kan sekvenser laddas ner från offentliga genetiska databaser. Eftersom dessa databaser är ofullständiga27, bör man sekvensera så många arter på listan som möjligt i huset för att fylla i den lokala referensdatabasen över sekvenser som kommer att användas i analysdesign. Prioritera närbesläktade arter, eftersom dessa är de mest sannolika icke-målen som kommer att förstärkas. Att fokusera på alla arter inom samma släkte eller familj som målarten är ett bra ställe att börja. Jämförelser med närbesläktade arter hjälper till att identifiera sekvensregioner som är unika för målarten. Detta kan hjälpa till att informera om hur analysen kan fungera i andra system eller platser. Mitokondriella regioner är det vanliga valet för analysutveckling, eftersom mer sekvensinformation från ett bredare antal arter finns tillgänglig vid mitokondriella gener som har använts i streckkodning av livsprojekt, och eftersom mitokondriellt DNA finns i mycket större koncentration i kopior / cell än nukleärt DNA24,28,29. Flera genregioner bör bedömas för vidare analysutveckling eftersom sekvenstäckningen varierar mellan taxa i databasen för genetiska arkiv. När den här lokala databasen med referenssekvenser har skapats används en kombination av manuell visualisering av justerade sekvensdata och datorprogram för att utforma primer/probe-analyserna. Man bör inte förlita sig strikt på programvara för att avgöra vilka analyser som ska testas. Det är viktigt att verifiera visuellt på inriktningar där primers och sonder sitter på målen och icke-mål för att få en bättre förståelse för hur de kan agera i en PCR. Slutligen omfattar analysscreening och optimering tre nivåer (i silico, in vitro och in situ)6,7,24,25. I silico design och testning är viktigt för att producera en kort lista över analyser med en god chans att lyckas, men empirisk (in vitro) testning är avgörande för att välja analysen med bästa faktiska prestanda. In vitro-optimering och testning av analyser inkluderar att mäta reaktionseffektiviteten och definiera analysens känslighet och specificitet. Gränser för detektion och kvantifiering är två parametrar som ofta förbises i analysutvecklingen men som är viktiga för datatolkning. Genom att köra flera replikat av standardkurvorna för en analys kan LOD och LOQ enkelt mätas1,5,30. Få studier diskuterar resultat med avseende på analysens LOD eller LOQ, men Sengupta et al. (2019) införlivar sin analyss LOD och LOQ i sin datatolkning och grafik för en tydligare förståelse av deras resultat31. Interna positiva kontroller bör också multiplexeras till den utformade analysen. Utan testning för PCR-hämning i proverna kan falska negativ uppstå24,32. Vi föreslår användning av en multiplexerad IPC-analys med målanalysen som den enklaste metoden för PCR-hämningstestning23. Slutligen är det nödvändigt att på plats testa analysen från fält- och laboratoriesamlade prover för att säkerställa att målförstärkning sker i miljöprover24.
Det finns begränsningar för användning av artspecifika, sondbaserade qPCR-analyser med eDNA-prover. Till exempel kan utformningen av flera analyser för testning begränsas av sekvenstillgänglighet, och kompromisser kan vara nödvändiga när det gäller aspekter av analysprestanda. Dessa val måste vägledas av studiens mål och ska rapporteras med resultaten26. Om målet till exempel är att upptäcka en sällsynt art och få positiva resultat förväntas, kan en analys med ofullständig specificitet (dvs. förstärkning av icke-målarter) användas om alla upptäckter kommer att verifieras genom sekvensering. Om målet är att övervaka det geografiska området för en art och eDNA-koncentrationsdata inte behövs, kan en analys med ofullständig effektivitet användas och data rapporteras endast som procentdetektering. Om inte alla potentiella konspecificer testas i laboratoriet, vilket sällan är möjligt, kan man inte med absolut säkerhet veta den verkliga specificiteten hos en analys. Till exempel designades och testades analysen mot flera sötvattenmusselarter i Clinch River. För att använda denna analys i ett annat flodsystem skulle vi behöva testa den mot en svit av arter på den nya platsen. Genetisk variation inom arten eller populationen som inte testas under analysutvecklingen kan också påverka specificiteten. Slutligen, även om en analys har kontrollerats ha hög teknisk prestanda, villkor ändras när du arbetar inom området. Icke-analysrelaterade tillstånd som vattenflöde, pH och djurbeteende kan ändra eDNA-detekterbarhet, liksom användning av olika eDNA-insamlings- och extraktionsprotokoll. Att använda analyser som är optimerade och väl beskrivna hjälper till att underlätta förståelsen av hur sådana parametrar påverkar eDNA-detektion.
EDNA:s område mognar bortom det förberedande analysstadiet till att öka standardiseringen av metoder och tekniker. Denna utveckling kommer att förbättra vår förståelse för eDNA-tekniker, förmågor och begränsningar. Optimeringsprocessen som vi beskriver ovan förbättrar en analyss känslighet, specificitet och reproducerbarhet. Det slutliga målet med denna förfining och standardisering av eDNA-metoder är att förbättra forskarnas förmåga att dra slutsatser baserade på eDNA-data samt öka slutanvändar- och intressentförtroendet för resultaten.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Alvi Wadud och Trudi Frost som hjälpte till med primerutveckling och testning. Finansiering för den analysdesign som rapporterades i denna studie tillhandahölls av Institutionen för försvarsstrategi strategisk miljöforskning och utvecklingsprogram (RC19-1156). All användning av handels-, produkt- eller firmanamn är endast för beskrivande ändamål och innebär inte godkännande från den amerikanska regeringen. Data som genereras under denna studie är tillgängliga som en USGS-datarea https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5.
96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
Microcentrifuge machine | Various | – | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |