Målet med detta protokoll är att leverera animaliska och konstgjorda blodmåltider till Aedes aegypti myggor genom en konstgjord membranmatare och exakt kvantifiera volymen av mjöl som intas.
Kvinnor av vissa myggarter kan sprida sjukdomar medan biter ryggradsdjur värdar för att få proteinrika blodmåltider som krävs för äggutveckling. I laboratoriet kan forskare leverera animaliska och konstgjorda blodmåltider till myggor via membranmatare, vilket möjliggör manipulering av måltidssammansättning. Här presenterar vi metoder för att mata blod och konstgjorda blodmåltider till Aedes aegypti myggor och kvantifiera volymen som konsumeras av enskilda honor.
Riktad utfodring och kvantifiering av konstgjorda / blodmåltider har breda användningsområden, inklusive testning av måltidskomponenternas effekter på myggbeteende och fysiologi, leverera farmakologiska föreningar utan injektion och infektera myggor med specifika patogener. Att tillsätta fluoresceinfärgning till måltiden före utfodring möjliggör efterföljande kvantifiering av måltidsstorleken. Måltidsvolymen som konsumeras av myggor kan mätas antingen efter vikt, om honorna ska användas senare för beteendeexperiment, eller genom att homogenisera enskilda honor i 96-brunnsplattor och mäta fluorescensnivåer med hjälp av en plattläsare som en slutpunktsanalys. Kvantifiering av måltidsstorlek kan användas för att avgöra om ändring av måltidskomponenterna förändrar måltidsvolymen som intas eller om måltidskonsumtionen skiljer sig mellan myggstammar. Exakt kvantifiering av måltidsstorleken är också avgörande för nedströmsanalyser, såsom de som mäter effekter på värdattraktion eller fecundity. De metoder som presenteras här kan anpassas ytterligare för att spåra måltidssammanfattning under dagarna eller för att inkludera flera urskiljbara markörer som läggs till olika måltider (som nektar och blod) för att kvantifiera konsumtionen av varje måltid av en enda mygga.
Dessa metoder gör det möjligt för forskare att på egen hand utföra mätningar med hög genomströmning för att jämföra måltidsvolymen som konsumeras av hundratals enskilda myggor. Dessa verktyg kommer därför att vara i stort sett användbara för myggforskare för att svara på olika biologiska frågor.
Vi presenterar ett protokoll för utfodring av modifierade blodmåltider till Aedes aegypti myggor med hjälp av en konstgjord membranmatare och exakt mäta måltidsvolymen som konsumeras av varje enskild mygga. Detta protokoll kan flexibelt anpassas för att ändra måltidens innehåll eller för att jämföra måltidsvolymen som konsumeras av olika experimentella grupper av myggor.
Ae. aegypti mygga hotar den globala hälsan genom att sprida patogener som orsakar sjukdomar inklusive gula febern, denguefeber, chikungunya och Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti honor är skyldiga blodmatare; De måste konsumera ryggradsdjur blod för att få det nödvändiga proteinet för äggutveckling, och varje koppling av ägg kräver en full blodmåltid från minst envärd 6,7,8. Den kvinnliga myggan biter först sin värd genom att genomborra huden med sin stylet och injicera saliv, som innehåller föreningar som utlöser värdens immunsvar9. Hon matar sedan genom att pumpa blod genom sin stil i sin midgut. Medan hon konsumerar en blodmåltid från en infekterad värd, kan hon inta blodburna patogener6,8, som sedan migrerar från myggans midgut till hennes salivkörtlar10. Kvinnliga myggor infekterade på detta sätt kan sprida sjukdom genom att injicera patogener tillsammans med saliv när man biter efterföljandevärdar 11,12. Att förstå och kvantifiera mekanismerna för blodmatningsbeteende är avgörande steg för att kontrollera överföringen av myggburna sjukdomar.
Många laboratorieprotokoll för mygguppfödning och experiment använder levande djur inklusive möss, marsvin eller människor som blodkälla13,14,15,16. Användningen av levande djur medför etiska problem samt komplexa krav på personalutbildning, djurhållning och djuromsorhållning samt efterlevnad av IACUC:s (Institutional Animal Care and Use Committee) politik. Det begränsar också de typer av föreningar som kan levereras till myggor, vilket begränsar de studier som kan utföras17.
Konstgjorda blodmatningsapparater, som vanligtvis använder ett membransystem för att simulera värdhud, är användbara verktyg för att studera blodmatningsbeteenden som kringgår behovet av underhåll av levande värdar. Helblod kan köpas från ett antal leverantörer och matas till myggor med uppvärmda, vattenmantlade konstgjorda membranmatare eller liknandeenheter 18,19. I detta protokoll demonstrerar vi användningen av små, engångsmembranmatare som kallas “Glytubes”. Denna membranmatare, tidigare publicerad av Costa-da-Silva et al. (2013)20, kan enkelt monteras från standard laboratorieutrustning, vilket gör den idealisk för att leverera blodmåltider till måttligt antal myggor och enkelt att skala upp för att testa större grupper eller flera måltidsformuleringar. Glytube är ett billigt och effektivt alternativ till andra kommersiella konstgjorda matare, vilket kan kräva större måltidsvolymer och är mer lämpliga för batchmatning av stora grupper av myggor på en enda måltidsformulering21.
Detta protokoll innehåller två avsnitt: förbereda/leverera konstgjorda måltider och kvantifiera konsumtionen. I det första avsnittet används Glytubes som ett effektivt sätt att leverera manipulerade dieter. Helblod kan ersättas med en helt konstgjord måltid för att jämföra effekterna av blodsubstitut i stället för en blodmåltid. Ett recept anpassat från Kogan (1990)22 presenteras här, även om flera konstgjorda måltidsformuleringar har utvecklats23,24. Dessutom är utfodring en mindre invasiv och mindre mödosam metod för att införa farmakologiska föreningar än injektion. På grund av den låga totala volymen som krävs för varje måltid (1–2 ml) ger detta protokoll en attraktiv leveransmetod för att minska mängden dyra reagenser. Ae. aegypti honor konsumerar lätt proteinfria måltider av saltlösning med adenosin 5′-tripfosfat (ATP)25,26, vilket ger en baslinje för att mäta effekterna av single meal komponenter. Till exempel är Neuropeptid Y-liknande receptor 7 (NPYLR7) i Ae. aegypti känd för att medla värdsökande undertryckande efter en proteinrik blodmåltid, och när NPYLR7-agonister läggs till en proteinfri saltlösningsmåltid uppvisar kvinnliga myggor värdsökande undertryckande som liknar dem som har konsumerat helblod7.
I det andra avsnittet presenteras steg för kvantifiering av volymen av varje måltid som konsumeras av en enskild kvinnlig mygga. Denna analys är fluorescensbaserad och fångar utfodringsstatus i högre upplösning än metoder där kvinnor klassificeras som “matade” eller “unfed” baserat på visuell bedömning av enbart bukdistension. Genom att tillsätta fluorescein till måltiden före utfodring kan måltidsvolymer som intas av individer kvantifieras genom att homogenisera varje mygga i en 96-brunnsplatta och mäta fluorescensintensitet som en avläsning. Denna analys kan mäta skillnader i utfodringskraft som svar på variabler som måltidssammansättning eller myggornas genetiska bakgrund. Exakt kvantifiering är avgörande för mellanmålsstorlekar, till exempel när kvinnor erbjuds suboptimala måltider som innehåller foderavskräckningsmedel eller när de konsumerar sackarosmåltider av varierandestorlek 27. Om matade myggor krävs för efterföljande beteendemässiga analyser efter måltidsstorleks kvantifiering, kan måltidsstorleken istället beräknas genom att väga bedövade honor i grupper och uppskatta den genomsnittliga ökade massan per individ. Även om vägningen är mindre exakt än fluoresceinmärkningen ger vägningen fortfarande en aggregerad uppskattning av måltidsvolymen och gör det möjligt att undersöka måltidens inverkan på nedströmsprocesser, såsom fecundity eller efterföljande värdattraktion. Medan blodmjölsstorleken är variabel och kan påverkas av en myriad avfaktorer 11,28,29, intas måltidsstorlekar mätt med de metoder som beskrivs här överensstämmer med tidigare kvantifieringar7,30,31.
För många laboratorieapplikationer erbjuder konstgjorda membranmatare distinkta fördelar jämfört med levande värdar genom att ge forskare möjlighet att direkt manipulera måltidens innehåll. Även om flera metoder finns tillgängliga för artificiell membranmatning, erbjuder den metod som beskrivs här fördelar i flexibilitet, kostnad och genomströmning. I jämförelse med andra kommersiella membranmatare kräver Glytube-analysen en liten måltidsvolym, vilket gör det till en effektiv leveransmekanism för kostsamma reagenser, inklusive läkemedel eller patogener, genom att minimera den totala volymensom krävs 7,35. Eftersom både den proteinfria saltlösningen och konstgjorda blodmåltider främjar engorgement, föreningar eller patogener kan läggas till antingen måltid som en hög genomströmning och icke-invasiva alternativ till injektioner. Dessutom kan varje komponent i Glytube enkelt tvättas, bytas ut eller skalas upp för att leverera och kvantifiera flera måltidstyper utan korskontaminering av matningsapparaten.
För att kvantifiera måltidsvolymer som konsumeras av myggor möjliggör den fluorescensbaserade metoden mer exakt måltidsstorleks kvantifiering än att väga myggorna före och efter utfodring. Det bör noteras att denna metod är en slutpunktsanalys. Däremot tillåter vägning myggorna att hållas vid liv för ytterligare experiment. Genom att använda en tallriksläsare kan den fluorescensbaserade metoden enkelt skalas upp för kvantifiering av måltider som konsumeras av hundratals enskilda kvinnor.
För att uppnå höga utfodringshastigheter måste en kombination av tillräckliga värdsignaler vara närvarande för att aktivera kvinnligt värdsökande beteende och locka kvinnor till mataren. Om myggor inte trängs under Glytube kanske måltiden inte värms ordentligt, eller CO2-leveransen kanske inte är tillräcklig. Tillsats av mänsklig lukt till membranytan ökar på ett tillförlitligt sätt attraktiviteten hos det konstgjorda membranet. Om myggor observeras under Glytube men misslyckas med att mata, kan måltidssammansättningen vara fel. Kvinnor får inte mata om måltiden i sig inte är varm, blodet är för gammalt eller om tillsatserna till måltiden är i sig aversiva eller orsakar en oönskad kemisk reaktion36. Ytterligare ATP ökar också utfodringshastigheterna på ett tillförlitligt sätt och kan skalas upp till en slutlig koncentration på 2 mM i vart och ett av recepten. Kvinnor får inte mata om parafilmen inte dras spänd över Glytube-locket; parafilmen ska vara enhetligt transparent och bör inte spännas, eftersom detta förhindrar att honan effektivt kan genomborra parafilmen med sin stil. Om måltiden läcker genom Glytuben på nätet kan parafilmen ha slitits sönder under sträckningsprocessen och bör bytas ut.
Att ändra måltidssammansättningen kan också göra det möjligt för forskare att manipulera den tid som behövs för att rensa måltiden från midgut samt det efterföljande värdsökande beteendet. Måltiderna som presenteras här kräver 24-36 h för matsmältning7 som liknar animaliskt härlett blod. Efter utfodring på någon av dessa måltider kommer kvinnor att undertrycka värdsökande under matsmältningstidens fönster. Eftersom saltlösningsmjölet saknar protein återvänder kvinnor till värdsökande efter att måltiden har rensats. Om en snabbare avkastning är önskvärd kan forskare välja alternativa “snabb clearing” saltlösning måltider som utsöndras i cirka 6 h27. Medan sammansättningen av saltlösningsmjölet som presenteras här matchas för att direkt jämföra resultat med den konstgjorda blodmåltiden, matchar den “snabba clearing” måltiden närmare fysiologiska saltnivåer som finns i ryggradsdjursblod.
De metoder som beskrivs här har begränsningar som bör övervägas innan du väljer den analys som är mest lämpad för forskarens experimentella mål. De fluoresceinmätningar som beskrivs tillåter inte myggor att användas igen för ytterligare experiment. Viktmätningar kan dock göras före kvantifiering av måltidsstorleken med fluoresceinanalysen. Om vikt och måltidsstorlek är konsekventa i flera försök för en viss måltid kan vikt användas som proxy i framtida experiment. Dessutom skiljer detta protokoll inte mellan underskott i värdsökande kontra blodmatningsbeteende; myggor som visar försämringar i att hitta membranmataren kommer att ha en minskning av utfodringshastigheter och / eller måltidsstorlek. Genom att lägga till en kamera för att spela in beteende under hela analysen kan forskare avgöra om honorna inte kan hitta Glytube, eller om de hittar Glytube, men inte matar.
Analysen som beskrivs här kan anpassas för att utforska många enastående frågor relaterade till utfodringsbeteende hos myggor. Till exempel kan bidraget från specifika blodproteiner utforskas genom att ändra förhållandet mellan ingående proteiner eller total proteinkoncentration i den konstgjorda blodmjölet. För att utvärdera måltidsstorlekar från flera utfodringshändelser kan färgämnen med distinkt fluorescensspektra läggas till för att skilja måltider från unika källor37. Detta protokoll kan också ändras för att separat stimulera de inre munstyckena som detekterar blod och som används för intag (dvs. stylet) och de kemosensoriska bihang som kommer i kontakt med huden (dvs. labium, ben) när myggan landar för att börjablodmatning 36. Till exempel, om ligands läggs direkt till måltiden, kontaktar de inte labiet och benen, eftersom membranet endast genomborras av styleten. Om ligands läggs till den yttre ytan av parafilmen istället, förblir de separerade från måltiden och kan kontaktas av labium och ben36. Slutligen är de detaljerade kinetikerna av blodmatningsbeteende inte väl förstådda och metoden som presenteras här kan ändras för att kombinera högupplöst spårning med maskininlärningsverktyg för att extrahera beteendemässiga avläsningar av rörelse, hållning ochutfodringsdynamik 38.
Detta protokoll syftar till att vara användarvänligt och kostnadseffektivt, med förmågan att betjäna forskare som använder farmakologiska och genetiska manipuleringar för att studera myggblodmatning och post-blodmatningsbeteende.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai och Trevor Sorrells för kommentarer om manuskripten och Zhongyan Gong och Kyrollos Barsoum för teknisk hjälp. Vi tackar Alex Wild för fotografier som används i figur 1. K.V. fick stöd av Boehringer Ingelheim Fonds doktorandstipendium. V.J. stöddes delvis av NIH T32-MH095246. Detta arbete stöddes delvis av ett anslag till The Rockefeller University från Howard Hughes Medical Institute genom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program till V.J. Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. NSF DGE-1325261 till V.J. Alla yttranden, slutsatser och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är upphovsmannens och återspeglar inte nödvändigtvis den nationella vetenskapsstiftelsens åsikter.
15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
3 mm diameter borosilicate solid-glass bead | MilliporeSigma | Z143928 | For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder |
32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup | VWR | 89009-668 | Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
96-well black polystyrene plate | ThermoFisher | 12-566-09 | |
96-well PCR plate sealing film | Bio-Rad | MSB1001 | Alternate options can be used |
96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9621 | Alternate options can be used |
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | MilliporeSigma | A6419 | |
Albumin (human serum) | MilliporeSigma | A9511 | |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213 | Alternate options can be used to block light entering fluorescein container |
Balance | Fisher Scientific | 01-911 | Alternate options can be used |
Bead mill homogenizer | Qiagen | 85300 | Not required if using pellet pestle grinder |
Cotton ball | Fisher Scientific | 22456880 | For nectar-feeding; alternate options can be used |
Defibrinated sheep blood | Hemostat Laboratories | DSB100 | Alternate options can be used |
Drosophila CO2 fly pad | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | Alternate options can be used |
Fluorescein | MilliporeSigma | F6377 | |
Fluorescence plate-reader | ThermoFisher | VL0000D0 | Alternate options can be used |
Gamma-globulin (human blood) | MilliporeSigma | H7379 | |
Glycerol | MilliporeSigma | G7893 | |
Hemoglobin (human) | MilliporeSigma | G4386 | |
Laboratory wrapping film – parafilm | Fisher Scientific | 13-374 | |
Magnetic stirrer | Fisher Scientific | 90-691 | Alternate magnetic stirrers can be used |
Microcentrifuge for 96-well plate | VWR | 80094-180 | Alternate options can be used |
Microcentrifuge Tubes | MilliporeSigma | 2236412 | Alternate options can be used |
Pellet pestle grinder | VWR | KT749521-1500 | Not required if using bead mill homogenizer |
Phosphate buffered solution (PBS) | Fisher Scientific | BW17-516F | Optional |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting |
Rubber bands | |||
Silicone tubing | McMaster Carr | Needed if using a fly pad for CO2 delivery | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
Sodium chloride (NaCl) | MilliporeSigma | S9888 | |
Stir bars | Fisher Scientific | 14-512 | Alternate magnetic stir bars can be used |
Translucent polypropylene storage box with removable lid | Example box used for feeding assays shown | ||
Vortex mixer | |||
Water bath | Alternate heating device may be used | ||
White 0.8 mm polyester mosquito netting | American Home & Habit Inc. | F03A-PONO-MOSQ-M008-WT | Alternate options can be used |