De forskellige virkninger af forskellige grader af hypotermi på myokardiebeskyttelse er ikke blevet grundigt evalueret. Formålet med denne undersøgelse var at kvantificere niveauet af celledød efter forskellige hypotermibehandlinger i en human kardiomyocytbaseret model, hvilket lagde grunden til fremtidig dybdegående molekylær forskning.
Iskæmi /reperfusion-afledt myokardie dysfunktion er et almindeligt klinisk scenarie hos patienter efter hjertekirurgi. Især følsomheden af kardiomyocytter til iskæmisk skade er højere end for andre cellepopulationer. På nuværende tidspunkt giver hypotermi betydelig beskyttelse mod en forventet iskæmisk fornærmelse. Undersøgelser af komplekse hypotermi-inducerede molekylære ændringer er dog fortsat begrænsede. Derfor er det vigtigt at identificere en kulturtilstand svarende til in vivo-forhold, der kan fremkalde skader svarende til den, der observeres i den kliniske tilstand, på en reproducerbar måde. For at efterligne iskæmilignende tilstande in vitro blev cellerne i disse modeller behandlet med ilt/ glukosemangel (OGD). Derudover anvendte vi en standardtidstemperaturprotokol, der blev brugt under hjertekirurgi. Desuden foreslår vi en tilgang til at anvende en enkel, men omfattende metode til kvantitativ analyse af myokardieskader. Apoptose og ekspressionsniveauer for apoptoserelaterede proteiner blev vurderet ved flowcytometri og ved hjælp af et ELISA-kit. I denne model testede vi en hypotese om virkningerne af forskellige temperaturforhold på kardiomyocytapoptose in vitro. Pålideligheden af denne model afhænger af streng temperaturkontrol, kontrollerbare eksperimentelle procedurer og stabile eksperimentelle resultater. Derudover kan denne model bruges til at studere den molekylære mekanisme af hypotermisk kardibeskyttelse, hvilket kan have vigtige konsekvenser for udviklingen af komplementære terapier til brug med hypotermi.
Iskæmi/reperfusion-afledt myokardie dysfunktion er et almindeligt klinisk scenarie hos patienter efter hjertekirurgi1,2. Under nonpulsatile lav flow perfusion og perioder med total kredsløbsstop, skader, der involverer alle typer af hjerteceller stadig opstår. Især følsomheden af kardiomyocytter til iskæmisk skade er højere end for andre cellepopulationer. På nuværende tidspunkt giver terapeutisk hypotermi (TH) betydelig beskyttelse mod en forventet iskæmisk fornærmelse hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi3,4. TH defineres som en kernetemperatur på 14-34 °C, selv om der ikke er enighed om en definition af køling under hjertekirurgi5,6,7. I 2013 foreslog et internationalt ekspertpanel et standardiseret rapporteringssystem til klassificering af forskellige temperaturområder af systemisk hypotermisk kredsløbsstop8. Baseret på elektroencefalografi og metabolismeundersøgelser af hjernen delte de hypotermi i fire niveauer: dyb hypotermi (≤ 14 °C), dyb hypotermi (14,1-20 °C), moderat hypotermi (20,1-28 °C) og mild hypotermi (28,1-34 °C). Ekspertkonsensussen gav en klar og ensartet klassificering, der gjorde det muligt for undersøgelser at være mere sammenlignelige og give mere klinisk relevante resultater. Denne beskyttelse, som TH yder , er baseret på dens evne til at reducere cellernes metaboliske aktivitet og yderligere begrænse deres højenergifosfatforbrug9,10. Men den rolle, TH i myokardie beskyttelse er kontroversiel og kan have flere virkninger afhængigt af graden af hypotermi.
Myokardie I/R er velkendt for at være ledsaget af øget celleapoptise11. Nylige rapporter har observeret, at programmeret kardiomyocytdød stiger under åben hjertekirurgi og kan falde sammen med nekrose og derved øge antallet af døde myokardieceller12. Derfor er reduktion af kardiomyocytapoptose en nyttig terapeutisk tilgang i klinisk praksis. I mus atrie HL-1 kardiomyocyt model, terapeutisk hypotermi blev vist sig at reducere mitokondrie frigivelse af cytochrom c og apoptose-inducerende faktor (AIF) under reperfusion13. Men effekten af temperatur i reguleringen af apoptose er kontroversiel og synes at afhænge af graden af hypotermi. Cooper og kolleger bemærkede, at sammenlignet med en normoterm kardiopulmonisk bypass kontrolgruppe blev apoptosehastigheden af myokardievæv fra svin med den dybe hypotermiske kredsløbsstop øget14. Derudover har resultaterne af nogle undersøgelser antydet, at dyb hypotermi kan aktivere apoptosevejen, mens mindre aggressiv hypotermi ser ud til at hæmme vejen12,15,16. Årsagen til dette resultat kan skyldes forvirrende virkninger forbundet med iskæmisk skade og manglende forståelse af de mekanismer, hvormed temperaturen påvirker myokardievæv. Derfor bør de temperaturgrænser, hvor apoptose forbedres eller dæmpes, defineres nøjagtigt.
For at få en bedre forståelse af de mekanismer, der er forbundet med hypotermiens effektivitet og give et rationelt grundlag for dens gennemførelse hos mennesker, er det vigtigt at identificere en kulturtilstand svarende til in vivo-tilstande, der kan producere skader svarende til den, der observeres for den kliniske tilstand på en reproducerbar måde. Et vigtigt skridt i retning af at nå dette mål er at etablere de optimale betingelser for at fremkalde kardiomyocytapoptose. Derfor undersøgte vi i denne undersøgelse de metodologiske detaljer om ilt-glukosemangelforsøg med dyrkede celler, en let in vitro-model af iskæmi-reperfusion. Desuden vurderede vi effekten af forskellige hypoxic-iskæmiske tider på kardiomyocytapoptose, og verificerede vores hypotese om effekten af forskellige temperaturforhold på celleapoptose in vitro.
Kompleksiteten af intakte dyr, herunder samspillet mellem forskellige typer celler, forhindrer ofte detaljerede undersøgelser af specifikke komponenter af I/R-skade. Derfor er det nødvendigt at etablere en in vitro cellemodel, der nøjagtigt kan afspejle de molekylære ændringer efter iskæmi in vivo. Forskning i OGD-modeller er tidligere blevet rapporteret13,22, og mange avancerede metoder er blevet etableret23,<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist finansieret af National Natural Science Foundation of China (81970265, 81900281,81700288), China Postdoctoral Science Foundation (2019M651904); og Kinas nationale forsknings- og udviklingsprogram (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit | Bio-Technology,China | C1062M | |
Cardiac myocyte growth supplement | Sciencell,USA | 6252 | |
Caspase 3 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1115 | |
Caspase 8 activity assay kit | Bio-Technology,China | C1151 | |
DMEM, no glucose | Gibco,USA | 11966025 | |
Dulbecco's modified eagle medium | Gibco,USA | 11960044 | |
Fetal bovine serum | Gibco,USA | 16140071 | |
Flow cytometry | CytoFLEX,USA | B49007AF | |
Human myocardial cells | BLUEFBIO,China | BFN60808678 | |
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Bio-Technology,China | C2006 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco,USA | 10378016 | |
Reactive oxygen species assay kit | Bio-Technology,China | S0033S | |
Three-gas incubator | Memmert,Germany | ICO50 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco,USA | 25200056 |