Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale
Summary
Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.
Abstract
L’acquisizione dei processi di replicazione dinamica e assemblaggio dei virus è stata ostacolata dalla mancanza di robuste tecnologie di ibridazione in situ (ISH) che consentano la marcatura sensibile e simultanea dell’acido nucleico virale e delle proteine. I metodi convenzionali di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA (FISH) spesso non sono compatibili con l’immunocolorazione. Abbiamo quindi sviluppato un approccio di imaging, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), che consente la visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine. Rispetto al DNA FISH convenzionale, MICDDRP utilizza la tecnologia ISH del DNA ramificato (bDNA), che migliora notevolmente la sensibilità e il rilevamento della sonda oligonucleotidica. Piccole modifiche di MICDDRP consentono l’imaging di proteine virali in concomitanza con acidi nucleici (RNA o DNA) di diversa filamento. Abbiamo applicato questi protocolli per studiare i cicli di vita di più patogeni virali, tra cui il virus dell’immunodeficienza umana (HIV)-1, il virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, il virus dell’epatite B (HBV), il virus dell’epatite C (HCV), il virus Zika (ZKV) e il virus dell’influenza A (IAV). Abbiamo dimostrato che possiamo etichettare in modo efficiente gli acidi nucleici virali e le proteine in una vasta gamma di virus. Questi studi possono fornirci una migliore comprensione meccanicistica di più sistemi virali e, inoltre, servire come modello per l’applicazione dell’imaging a fluorescenza multipla di DNA, RNA e proteine in un ampio spettro di sistemi cellulari.
Introduction
Mentre migliaia di anticorpi commerciali sono disponibili per marcare specificamente le proteine tramite approcci convenzionali di immunocolorazione, e mentre le proteine di fusione possono essere progettate con tag fluorescenti foto-ottimizzati per tracciare più proteine in un campione1, la visualizzazione microscopica delle proteine spesso non è compatibile con l’ibridazione convenzionale della fluorescenza del DNA in situ (FISH)2 . Le limitazioni tecniche nella visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine utilizzando approcci basati sulla fluorescenza hanno ostacolato una comprensione approfondita della replicazione del virus. Il monitoraggio sia dell’acido nucleico virale che delle proteine durante il corso dell’infezione consente ai virologi di visualizzare i processi fondamentali che sono alla base della replicazione e dell’assemblaggio del virus 3,4,5,6.
Abbiamo sviluppato un approccio di imaging, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein (MICDDRP)3, che utilizza la tecnologia in situ del DNA ramificato (bDNA) per migliorare la sensibilità del rilevamento degli acidi nucleici 7,8,9 . Inoltre, questo metodo utilizza sonde accoppiate per una maggiore specificità. Le sonde specifiche per la sequenza di bDNA utilizzano DNA di preamplificatori ramificati e amplificatori per produrre un segnale intenso e localizzato, migliorando i precedenti metodi di ibridazione che si basavano sul targeting di regioni ripetute nel DNA9. Le cellule infette in un contesto clinico spesso non contengono abbondante materiale genetico virale, fornendo una merce per un metodo sensibile per il rilevamento di acidi nucleici fluorescenti in contesti diagnostici. La commercializzazione della tecnologia del bDNA attraverso approcci come RNAscope7 e ViewRNA10 ha riempito questa nicchia. La sensibilità dell’imaging a fluorescenza del bDNA ha anche un’importante utilità nella biologia cellulare, consentendo il rilevamento di scarse specie di acidi nucleici in modelli di coltura cellulare. Il grande miglioramento della sensibilità rende i metodi di imaging basati sul bDNA adatti allo studio dei virus. Una potenziale carenza, tuttavia, è che questi metodi si concentrano sulla visualizzazione di RNA o RNA e proteine. Tutte le cellule replicanti e molti virus hanno genomi di DNA o formano DNA durante il loro ciclo di replicazione, rendendo altamente desiderabili metodi in grado di visualizzare sia l’RNA e il DNA, sia le proteine.
Nel protocollo MICDDRP, eseguiamo bDNA FISH per la rilevazione di acido nucleico virale utilizzando il metodo RNAscope, con modifiche7. Una delle principali modifiche a questo protocollo è l’ottimizzazione del trattamento della proteasi dopo la fissazione chimica. Il trattamento con proteasi facilita la rimozione delle proteine legate all’acido nucleico per migliorare l’efficienza di ibridazione della sonda. Il trattamento con proteasi è seguito dall’incubazione con sonde oligonucleotidiche ramificate. Dopo l’applicazione di sonde bDNA, i campioni vengono lavati e successivamente incubati con DNA di preamplificatore di segnale e amplificatore. L’ibridazione multiplexata in situ (ISH), marcatura di bersagli genici multipli, richiede sonde bersaglio con diversi canali di colore per la differenziazione spettrale7. L’incubazione con amplificatori del DNA è seguita da immunofluorescenza (IF).
bDNA ISH impartisce miglioramenti nel rapporto segnale-rumore mediante amplificazione di segnali target-specifici, con una riduzione del rumore di fondo da eventi di ibridazione non specifici 7,11. Le sonde target sono progettate utilizzando programmi software disponibili pubblicamente che prevedono la probabilità di eventi di ibridazione non specifici, oltre a calcolare la temperatura di fusione (Tm) dell’ibrido sonda-bersaglio 7,11. Le sonde bersaglio contengono una regione da 18 a 25 basi complementare alla sequenza DNA/RNA bersaglio, una sequenza distanziatrice e una sequenza di coda a 14 basi. Una coppia di sonde bersaglio, ciascuna con una sequenza di coda distinta, si ibridano in una regione bersaglio (che copre ~ 50 basi). Le due sequenze di coda formano un sito di ibridazione per le sonde preamplificatore, che contengono 20 siti di legame per le sonde amplificatore, che contengono inoltre 20 siti di legame per la sonda di etichetta. Ad esempio, una regione di una kilobase (kb) sulla molecola di acido nucleico è presa di mira da 20 coppie di sonde, creando un’impalcatura molecolare per l’ibridazione sequenziale con il preamplificatore, l’amplificatore e la sonda di etichetta. Ciò può quindi portare a una resa teorica di 8000 etichette fluorescenti per molecola di acido nucleico, consentendo il rilevamento di singole molecole e grandi miglioramenti rispetto agli approcci convenzionali FISH7 (vedi Figura 1A per lo schema dell’amplificazione del segnale bDNA). Per impostare le sonde per ISH multiplexato, ogni sonda target deve trovarsi in un canale di colore diverso (C1, C2 o C3). Queste sonde target con diversi canali di colore possiedono distinte sequenze di coda a 14 basi. Queste sequenze di coda collegheranno amplificatori di segnale distinti con diverse sonde fluorescenti, consentendo così una facile differenziazione spettrale su più bersagli. Nel protocollo presentato, la tabella 4 nella fase 9, fornisce ulteriori informazioni sull’etichettatura fluorescente delle sonde target. Inoltre, la Figura 2 e la Figura 3 forniscono esempi di come abbiamo scelto l’amplificatore 4-FL appropriato (A, B o C) (sonda fluorescente e fase finale di ibridazione) per ottenere una marcatura fluorescente specifica di più bersagli virali di acidi nucleici dopo infezioni da HIV-1 e HTLV-1.
Abbiamo dimostrato diverse applicazioni della visualizzazione simultanea della fluorescenza di RNA, DNA e proteine, osservando le fasi critiche della replicazione del virus con alta risoluzione spaziotemporale 3,4,5. Ad esempio, la visualizzazione simultanea di RNA virale, DNA citoplasmatico e nucleare e proteine ci ha permesso di visualizzare eventi chiave durante l’infezione da HIV-1, incluso il seguito di nuclei contenenti RNA nel citoplasma prima dell’ingresso nucleare e dell’integrazione del DNA provirale3. Inoltre, abbiamo applicato MICDDRP per caratterizzare gli effetti dei fattori dell’ospite e del trattamento farmacologico sull’infezione virale e sulla replicazione 4,5. In Ukah et al., abbiamo monitorato la riattivazione della trascrizione dell’HIV-1 in modelli cellulari di latenza trattati con diversi agenti di inversione della latenza per visualizzare la trascrizione dell’HIV e l’inversione della latenza4. Inoltre, MICDDRP può permetterci di visualizzare i cambiamenti fenotipici associati all’inibizione antivirale attribuita al trattamento con piccole molecole o alla restrizione del fattore ospite. Come prova di concetto per la robustezza e l’ampia applicabilità del nostro approccio, abbiamo dimostrato che possiamo utilizzare le modifiche del nostro protocollo per etichettare in modo efficiente l’acido nucleico virale per seguire l’infezione non solo nel virus dell’immunodeficienza umana (HIV)-1, ma anche nel virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, nel virus dell’epatite B (HBV), nel virus dell’epatite C (HCV), Virus Zika (ZIKV) e virus dell’influenza A (IAV). Poiché il ciclo di vita dell’HIV-1 è costituito sia da DNA virale che da specie di RNA, abbiamo eseguito la maggior parte della nostra ottimizzazione di MICDDRP seguendo la cinetica di replicazione dell’HIV-1. Tuttavia, in aggiunta, abbiamo dimostrato che possiamo tracciare la sintesi di diversi trascritti di RNA virale di uno o entrambi i filamenti senso (+) e antisenso (-) in virus come ZIKV, IAV, HBV e HCV per monitorare la trascrizione virale e la replicazione 3,4,5,6. Gli studi mirano a migliorare la comprensione meccanicistica di diversi processi virali e servono come linea guida per implementare questa tecnologia di imaging a fluorescenza in una vasta gamma di modelli cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
La visualizzazione simultanea di RNA, DNA e proteine richiede spesso un’ampia ottimizzazione. Due metodi comunemente usati sono l’etichettatura con 5-etinil-2-deossiuridina (EdU) e DNA FISH. L’etichettatura EdU è stata applicata per visualizzare simultaneamente DNA virale e proteine, poiché l’EdU è incorporato nel DNA nascente e successivamente etichettato con coloranti fluorescenti contenenti azoturo tramite chimica a clic. L’etichettatura EdU può quindi essere utilizzata per monitorare la cinetica di repli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in tutto o in parte dal National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 e U54 AI150472). Ringraziamo il Dr. Raymond F. Schinazi e Sadie Amichai per aver fornito cellule infette dal virus dell’influenza A.
Materials
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
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