हम एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में स्वचालित इमेजिंग प्रक्रियाओं के साथ-साथ सरणी टोमोग्राफी नमूनों के रूप में उपयोग के लिए बड़े हस्तांतरण समर्थन पर धारावाहिक वर्गों के रिबन और उनके संग्रह की तैयारी का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल स्थानीय, दुर्लभ घटनाओं की स्क्रीनिंग, पुनर्प्राप्ति और लक्षित इमेजिंग और बड़े डेटा वॉल्यूम के अधिग्रहण की अनुमति देता है।
नैनोमीटर संकल्प पर सेलुलर और संरचनात्मक विवरणों की इमेजिंग के लिए जीव विज्ञान और दवा में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लागू की जाती है। ऐतिहासिक रूप से, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) ने सेल अल्ट्रास्ट्रक्चर में अंतर्दृष्टि प्रदान की, लेकिन हाल के दशक में, आधुनिक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) के विकास ने कोशिकाओं के अंदर देखने का तरीका बदल दिया है। हालांकि TEM के संकल्प बेहतर है जब प्रोटीन स्तर संरचनात्मक विवरण की जरूरत है, SEM-संकल्प ऑर्गेनेल स्तर के सेल जीव विज्ञान से संबंधित सवालों के बहुमत के लिए पर्याप्त है । प्रौद्योगिकी में उन्नति ने सीरियल ब्लॉक-फेस इमेजिंग (एसबीएफ-एसईएम) और फोकस्ड आयन बीम एसईएम (एफईबी-एसईएम) जैसे स्वचालित वॉल्यूम अधिग्रहण समाधानों को सक्षम किया। फिर भी, इस दिन के लिए, इन तरीकों अक्षम रहते है जब पहचान और ब्याज के क्षेत्रों के लिए नेविगेशन महत्वपूर्ण हैं । इमेजिंग से पहले लक्षित क्षेत्रों के सटीक स्थानीयकरण के साधनों के बिना, ऑपरेटरों को (एसबीएफ-एसईएम में) की आवश्यकता से अधिक डेटा प्राप्त करने की आवश्यकता होती है, या इससे भी बदतर, कई ग्रिड तैयार करते हैं और उन सभी (TEM में) छवि बनाते हैं। हम एसईएम में सरणी टोमोग्राफी का उपयोग करके “पार्श्व स्क्रीनिंग” की रणनीति का प्रस्ताव करते हैं, जो ब्याज के क्षेत्रों के स्थानीयकरण की सुविधा प्रदान करता है, जिसके बाद कुल नमूना मात्रा के प्रासंगिक अंश की स्वचालित इमेजिंग होती है। इमेजिंग के दौरान सरणी टोमोग्राफी नमूनों को संरक्षित किया जाता है, और उन्हें बार-बार इमेजिंग के लिए तैयार अनुभाग पुस्तकालयों में व्यवस्थित किया जा सकता है। कई उदाहरण दिखाए जाते हैं जिनमें पार्श्व स्क्रीनिंग हमें संरचनात्मक विवरणों का विश्लेषण करने में सक्षम बनाती है जो किसी अन्य विधि के साथ उपयोग करने के लिए अविश्वसनीय रूप से चुनौतीपूर्ण हैं।
EM से संबंधित तकनीकों के महत्व के बावजूद, उन्हें महारत हासिल करने के लिए आवश्यक प्रयास पूरे क्षेत्र विशेषज्ञों की एक छोटी संख्या तक ही सीमित रहता है । एक महत्वपूर्ण कठिनाई EM के लिए संरक्षित नमूनों में ब्याज के एक क्षेत्र (आरओआई) की पहचान और पुनर्प्राप्ति है। ऑप्टिक माइक्रोस्कोपी द्वारा और ईएम अवलोकन के लिए प्रसंस्करण के बाद विश्लेषण किए जाने पर एक ही नमूने की उपस्थिति काफी अलग होती है। रासायनिक रूप से तैयार नमूनों के लिए परिवर्तन निर्जलीकरण चरणों के बाद एनिसोट्रोपिक नमूना सिकुड़न (प्रत्येक आयाम में ~ 10%) और निर्धारण और धुंधला प्रोटोकॉल(चित्रा 1A)में ऑस्मियम का उपयोग करते समय फ्लोरेसेंस की हानि शामिल है। अल्ट्राथिन सेक्शनिंग के लिए, नमूने विभिन्न रणनीतियों(चित्रा 1B)का उपयोग करके एपॉक्सी या एक्रेलिक रेजिन में एम्बेडेड होते हैं। इस तैयारी के सफल परिणामों के लिए, पूरे नमूने को टुकड़ों में विभाजित किया जाना चाहिए जो 1 मिमी x 1 मिमी से अधिक नहीं हैं। मानक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) अवलोकन शर्तों की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, नमूने के इस छोटे से हिस्से को आगे 50-150 एनएम मोटी स्लाइस तक विभाजित किया जाता है। परिणामस्वरूप ग्रेस्केल छवियां किसी भी अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक(चित्रा 1C)की तुलना में अधिक विस्तार से पूरे नमूने के एक मिनट के अंश के ऊतक संगठन और ऑर्गेनेल संरचना दिखाती हैं। एक विशिष्ट TEM डेटासेट कोशिकाओं और ऊतकों में 3डी स्थान में स्वाभाविक रूप से होने वाली प्रक्रियाओं को समझने के लिए सैद्धांतिक रूप से एक्सपेरिमेंट किया गया 2D जानकारी प्रदान करता है। चित्रा 1D अल्ट्रास्ट्रक्चरल वॉल्यूम अधिग्रहण की चुनौती प्रस्तुत करता है: यदि 50 एनएम मोटाई पर पक्ष 1,000 माइक्रोन का घन अनुभागित किया जाता है, तो पूरे वॉल्यूम को कवर करने के लिए 20,000 वर्गों की आवश्यकता होगी; एक 500 माइक्रोन साइड क्यूब के लिए, यह 10,000 वर्गों होगा। 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन वॉल्यूम को कवर करने के लिए, 1,000 अनुभाग “केवल” आवश्यक हो सकते हैं। इस मात्रा को मैन्युअल रूप से प्राप्त करना व्यावहारिक रूप से असंभव है और स्वचालन के साथ प्रदर्शन करना बेहद चुनौतीपूर्ण है। यदि, नमूना गहराई के अलावा, हमें ऐसे काल्पनिक क्यूब्स की पूरी सतह को कवर करने की आवश्यकता है, तो उचित संकल्प पर 1 माइक्रोन2 सतह का कवरेज एक गंभीर रसद मुद्दा(चित्रा 1E) बन जाता है। जबकि असाधारण बड़े पैमाने पर परियोजनाओं के लिए, जैसे कनेक्टोमिक्स दृष्टिकोण, बड़ी संख्या में वर्ग महत्वपूर्ण हैं, अधिकांश “सांसारिक” ईएम परियोजनाओं के लिए, अवलोकन के लिए आवश्यक अधिक वर्गों का उत्पादन एक महत्वपूर्ण नुकसान प्रस्तुत करता है।
3डी अल्ट्रास्ट्रक्चरल जानकारी प्राप्त करने के लिए कई तरीके हैं: सीरियल सेक्शनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टेम), टेम टोमोग्राफी, ऐरे टोमोग्राफी (एटी), सीरियल ब्लॉक फेस इमेजिंग स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम), और फोकस्ड आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (FIB-SEM)। इन तरीकों के बीच मुख्य अंतर खंड रणनीति है और क्या छवि अधिग्रहण धारा पीढ़ी1के साथ मिलकर है । सीरियल सेक्शनिंग टेम में, स्लॉट ग्रिड पर अनुक्रमिक खंड एकत्र किए जाते हैं, तेम छवियां इन दृश्यों से उत्पन्न होती हैं और2,3,4,5गठबंधन होती हैं। टेम टोमोग्राफी में, ग्रिड पर 150-300 एनएम वर्गों से झुकाव श्रृंखला, और जब धारावाहिक अनुभागिंग के साथ मिलकर, एक बहुत ही उच्च संकल्प प्रदान करते हैं, हालांकि अपेक्षाकृत छोटी मात्रा6,7,8। एटी दृष्टिकोण अपेक्षाकृत बड़े समर्थन पर अनुभागों के विविध मैनुअल और अर्ध-स्वचालित शिष्टाचार के साथ भौतिक अनुभागिंग का उपयोग करता है, जैसे ग्लास कवरलिप, सिलिकॉन वेफर्स या एक विशेष टेप। छवि अधिग्रहण के लिए, एसईएम में समर्थन का विश्लेषण किया जाता है, विविध छवि अधिग्रहण रणनीतियों के साथ9,10, 11,12,13,14, 15 उपलब्ध हैं। एसबीएफ-एसईएम के लिए, एसईएम चैंबर के अंदर सीधे सेट एक हीरे के चाकू के साथ एक मिनी-माइक्रोटॉम का उपयोग करके भौतिक खंड प्राप्त किया जाता है, जिसमेंराल ब्लॉक16, 17, 18,19की सतह से उत्पन्न एसईएम छवि होती है। FIB-SEM के लिए, आयन स्रोत नमूने की पतली परतों को हटा देता है, जिसके बाद एसईएम20, 21द्वारा उजागर सतह की स्वचालित इमेजिंग होती है। TEM-टोमोग्राफी और एटी भौतिक वर्गों को उत्पन्न करता है, जिसे आवश्यक होने पर फिर से इमेज किया जा सकता है, जबकि एफएसबीएफ-एसईएम और एफआईबी-एसईएम इमेजिंग के बाद अनुभाग को खत्म करते हैं। मल्टी-बीम एसईएम द्वारा इमेज किए गए भौतिक वर्गों का हाल ही में संयोजन उन तरीकों का संयोजन प्रदान करता है जो छवि अधिग्रहण22की गति के “अड़चन” मुद्दे को हल करते हैं। इन तकनीकों में से प्रत्येक जिस तरह से EM डेटा प्राप्त किया जा सकता है और विश्लेषण में क्रांतिकारी बदलाव आया है, और प्रत्येक दृष्टिकोण अपने व्यावहारिक एक दिए गए अनुसंधान सवाल से संबंधित प्रभावों है ।
तैयारी की प्रकृति और अल्ट्रास्ट्रक्चरल आयामों के पैमाने को देखते हुए, यह भविष्यवाणी करना सीधा नहीं है कि नमूना ब्लॉक(Figure1D,E)में एक विशिष्ट लक्ष्य संरचना कहां स्थित है। आरओआई स्थानीयकरण के लिए एक समाधान शुरू से ही वांछित संकल्प पर पूरे ब्लॉक से छवियों को रिकॉर्ड कर रहा है। ब्याज की संरचनाएं माइक्रोस्कोप से दूर होने पर अधिग्रहीत डेटा वॉल्यूम में हो सकती हैं। अधिग्रहण समय और इस रणनीति से जुड़े डेटा हैंडलिंग समस्याग्रस्त हैं। रिकॉर्ड किए गए डेटा की मात्रा को कम करना वांछनीय है, खासकर यदि आरओआई ऊतक ब्लॉक की तुलना में बहुत छोटे हैं, यानी, यदि ब्याज की वस्तुएं विशिष्ट प्रकार की कोशिकाएं हैं (पूरे अंग नहीं)। एक ही नमूने 23 , 24 , 25 , 26 ,27 , 28 , 28,29केभीतर तैयार होने से पहले या बाद में फ्लोरेसेंस को संरक्षित और स्थानीयकृत किए जाने पर विभिन्न सहसंबद्ध प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक (पीएनएम) सफल हो सकती हैं । फिर भी, कई सेलुलर संरचनाएं केवल ज्ञात अल्ट्रास्ट्रक्चर के आधार पर फ्लोरेसेंस सहसंबंध के बिना भी पहचानने योग्य हैं। इन मामलों के लिए, हमारा मानना है कि पार्श्व स्क्रीनिंग ऐरे टोमोग्राफी आरओआई स्थानीयकरण और अल्ट्रास्ट्रस्ट्रक्चरल सूचना गुणवत्ता में निवेश किए गए प्रयास के बीच एक संतुलन ट्रेडऑफ प्रदान करता है। इस रणनीति का उपयोग करके, वेफर पर अनुभागों के एक उप-सेट को नियमित अंतराल के भीतर जांचा जाता है, जिसे आरओआई के आकार और प्रकृति के आधार पर स्थापित किया जा सकता है। एक बार ROIs मिल जाने के बाद, डेटा अधिग्रहण को एंकर अनुभाग के बाद शुरू होने और समाप्त होने वाले अनुभागों की एक सतत श्रृंखला में स्थापित किया जाता है, जो संबंधित जानकारी को लक्षित तरीके से एकत्र करता है।
हम उस समय के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो कई वर्गों में क्षेत्रों या रुचि की घटनाओं के अधिग्रहण को सरल और तेज करता है और बेहतर-गठबंधन छवि मात्रा प्राप्त करता है। पार्श्व स्क्रीनिंग और मल्टीस्टेप अधिग्रहण ठीक लक्षित क्षेत्रों में बहुत उच्च संकल्प के साथ डेटा का उत्पादन करते हैं । हम जिस प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, वह 3D EM डेटा अधिग्रहण की कई चुनौतियों का वर्णन करती है, जैसा कि यह प्रदान करता है: नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को मौलिक रूप से बदले बिना नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ अनुकूलता; खंड और एसईएम अधिग्रहण के लिए लक्षित स्थानीयकरण; सेटअप के दौरान कम समय और प्रयास; परिणामस्वरूप मात्रा के बेहतर संरेखण के साथ कई वर्गों में क्षेत्रों की इमेजिंग; और एक सिले मोज़ेक चित्र में विभिन्न छवियों को संकलित करने के लिए एक चिकनी सिलाई और संरेखण प्रक्रिया। हम प्रकाशित और चल रहे परियोजनाओं से कई नमूनों के साथ हमारी विधि की ताकत प्रदर्शित करने के लिए चुना है । हमारा मानना है कि यह दृष्टिकोण सीमित ईएम अनुभव वाले जांचकर्ताओं के लिए भी लक्षित ईएम डेटा की पीढ़ी और अधिग्रहण को काफी हद तक सुविधाजनक बना सकता है।
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं और जीवों की अल्ट्रास्ट्रक्चर में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, जिसके लिए अक्सर उनके 3-आयामी संदर्भ में रुचि की छवि संरचनाओं के लिए वांछनीय होता है। अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए कई ईएम रणनीति के बावजूद, अभी भी कोई “स्वर्ण मानक” समाधान नहीं है। मुख्य कारण नमूनों की विस्तृत विविधता, कई जैविक प्रश्न हैं, जिन्हें अक्सर एक सिलवाया दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। प्रस्तावित एटी वर्कफ़्लो नमूना प्रसंस्करण, डेटा अधिग्रहण, मूल्यांकन और भंडारण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसके अलावा, संशोधित चाकू सरणी अधिग्रहण को सरल बनाने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है। वेफर्स पर वर्गों का कॉम्पैक्ट लेआउट नमूनों के अवलोकन और बाद के भंडारण दोनों के लिए सुविधाजनक है। यह व्यवस्था क्षैतिज रूप से रिबन से रिबन तक जाकर नमूनों की “पार्श्व स्क्रीनिंग” को सक्षम बनाती है और प्रत्येक पर केवल एक अनुभाग को स्कैन करती है, जिससे आरओआई को स्थानीय बनाने के लिए आवश्यक समय काफी कम हो जाता है। प्रस्तावित डेटा अधिग्रहण परिदृश्य छोटे और बेतरतीब ढंग से वितरित क्षेत्रों को लक्षित करने की सुविधा प्रदान करते हैं। एक बार पाए जाने पर, एटी/एसईएम उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को ब्याज की मात्रा तक सीमित करता है, चाहे वह मैन्युअल रूप से या स्वचालित कार्य की मदद से किया गया हो। सीमित मात्रा के लिए मैन्युअल रूप से पूरा किया जा सकता है, ऑपरेटर के साथ नमूना के माध्यम से नेविगेट और इमेजिंग क्षेत्रों को एक-एक करके परिभाषित करते हैं। सॉफ्टवेयर का स्वचालित मॉड्यूल बड़े वर्गों पर छोटे क्षेत्रों की इमेजिंग के लिए एक लचीला छवि अधिग्रहण रणनीति प्रदान करता है। इस सॉफ्टवेयर में स्वचालन सैकड़ों वर्गों पर बड़े उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है, जो एसबीएफआई के समान वॉल्यूम प्राप्त करता है। सभी वर्गों की अवलोकन छवियों को रिकॉर्ड करना आरओआई स्थानीयकरण को सरल बनाता है और माइक्रोस्कोप पर बिताए गए समय को कम करता है। चूंकि अवलोकन और उच्च संकल्प पूर्वावलोकन की रिकॉर्डिंग के दौरान अनुभागों को नुकसान नहीं पहुंचाया जाता है, इसलिए एटी/एसईएम अन्य आरओआई के और डेटा एकत्र करने के लिए या उच्च संकल्प पर नमूने का पुन: उपयोग करने की अनुमति देता है।
छवि अधिग्रहण समय 3 डी ईएम के सबसे महत्वपूर्ण (और सबसे महंगे) पहलुओं में से एक है और इसलिए प्रयोग डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए। हालांकि यह आश्चर्य की बात है कि इमेजिंग बड़े क्षेत्रों में छोटे क्षेत्रों की इमेजिंग से अधिक समय लगता है, प्रभाव का अनुमान लगाना आसान है: चयनित इमेजिंग मापदंडों के आधार पर, प्रत्येक अनुभाग पर अधिग्रहण का समय सेकंड से घंटों तक भिन्न हो सकता है। क्रिटिकल इमेजिंग पैरामीटर में देखने के क्षेत्र का आकार, संकल्प और समय निवास करना शामिल है। 10एनएम प्रति पिक्सेल और 1 माइक्रोस निवास समय के लक्ष्य संकल्प को मानते हुए, 20 माइक्रोन x 20 माइक्रोन, 100 माइक्रोन x100 माइक्रोन, या 500 माइक्रोन x500 माइक्रोन के एक क्षेत्र इमेजिंग रिकॉर्ड करने के लिए 4 सेकंड, 100 सेकंड, या 2,500 एस लेता है। हम पूर्ण इमेजिंग नौकरी के लिए आवश्यक समय का अनुमान लगाने के लिए वर्गों की संख्या से इन प्रति-अनुभाग इमेजिंग समय को गुणा कर सकते हैं। लंबे समय तक प्रति-खंड इमेजिंग समय स्वीकार्य हो सकता है यदि वर्गों की संख्या छोटी है या यदि माइक्रोस्कोप उपकरण समय कोई चिंता का विषय नहीं है।
हालांकि, ज्यादातर मामलों में रिकॉर्डिंग का समय रात भर नौकरी या वीकेंड जॉब तक सीमित करना जरूरी है । 3 डी ईएम का एक समान रूप से महत्वपूर्ण पहलू जिस पर विचार किया जाना चाहिए, परिणामी छवि डेटा की मात्रा और संरचना है। 100 खंडों में उपर्युक्त इमेजिंग फ़ील्ड रिकॉर्ड करने से क्रमशः 400 एमबी, 10 जीबी या 250 जीबी इमेज डेटा उत्पन्न होता है; 500 माइक्रोन x 500 माइक्रोन छवियां प्रत्येक 2 जीबी से बड़ा होने का अतिरिक्त मुद्दा पेश करते हैं। डेटा मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले कई सॉफ्टवेयर प्रोग्राम इस आकार की छवियों को नहीं खोल सकते हैं।
इमेजिंग समय को कम करने के लिए, बाद के डेटा मूल्यांकन (जैसे, पुनर्निर्माण, ट्रेसिंग) के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए पिक्सेल निवास समय का चयन करना महत्वपूर्ण है, और रिकॉर्डिंग को परिभाषित आरओआई तक सीमित करना महत्वपूर्ण है। सॉफ्टवेयर का एटी विस्तार सीरियल सेक्शन में छोटे क्षेत्रों में इमेज एक्विजिशन की सुविधा देता है । सॉफ्टवेयर मैनुअल और स्वचालित वर्कफ्लो और कई अर्ध-स्वचालित वेरिएंट का समर्थन करता है: इमेजिंग क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से तैनात किया जा सकता है और प्रत्येक अनुभाग पर केंद्रित किया जा सकता है, या उपयोगकर्ता स्वचालित अनुभाग खोजक और स्थिति संरेखण सुविधाओं का उपयोग कर सकता है। नमूना प्रकार या इमेजिंग लक्ष्यों द्वारा चुने गए और समर्थित स्वचालन के स्तर के आधार पर, सैकड़ों वर्गों में छवि अधिग्रहण स्थापित करने के लिए आवश्यक समय एक संपूर्ण कार्यदिवस (मैन्युअल रूप से किया गया) या केवल कुछ मिनट ले सकता है। सिद्धांत रूप में, सरणी टोमोग्राफी छोटे आरओआई प्राप्त करने के लिए अन्य 3डी ईएम विधियों की तुलना में इसे अधिक चुनौतीपूर्ण बनाती है; लगातार वर्गों पर असटीक क्षेत्र प्लेसमेंट बड़े क्षेत्रों को प्राप्त करके मुआवजा दिया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि आरओआई आकार में 20 माइक्रोन x 20 माइक्रोन है और इमेजिंग फ़ील्ड की सेक्शन-टू-सेक्शन स्थिति परिवर्तनशीलता 10μm है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि आरओआई प्रत्येक छवि में पूरी तरह से कैप्चर किया गया है, हर अनुभाग पर 40 माइक्रोन x 40 माइक्रोन छवियों को प्राप्त करने की आवश्यकता है। वास्तविक दुनिया छवि स्थिति परिवर्तनशीलता स्थिति संरेखण या उपयोगकर्ता के धैर्य के लिए सॉफ्टवेयर सुविधाओं की उपलब्धता या गुणवत्ता के आधार पर 100 माइक्रोन से <10 माइक्रोन तक है। इस सॉफ्टवेयर के साथ, अधिकांश नमूनों में बहुत अधिक मैन्युअल हस्तक्षेप के बिना 10 माइक्रोन प्राप्त किया जा सकता है।
किसी भी तकनीक की तरह, एटी में कई कमजोर बिंदु हैं जो सफल डेटा अधिग्रहण को प्रभावित कर सकते हैं, और कई अन्य खंड-आधारित तरीकों के समान हैं। खाली राल बनाम ऊतक के समरूप वितरण की कमी के परिणामस्वरूप घुमावदार या टूटी हुई सरणी हो सकती है। चरम मामलों में, अनुभाग समर्थन(चित्रा 6A)से अलग हो सकते हैं। काटने की प्रक्रिया के दौरान परिवर्तनीय संपीड़न या खींचने से ऐसे सिलवटें बन सकती हैं जो बाद के खंडों(चित्रा 6B)पर परिवर्तनीय क्षेत्रों में नमूने को बाधित कर सकती हैं। चाकू के निशान एक क्षतिग्रस्त चाकू(चित्रा 6C)का उपयोग कर एकत्र वर्गों की सतह पर दिखाई दे सकते हैं । अनुभागिंग स्थितियों में अंतर सामयिक अनुभाग संपीड़न और मोटाई मतभेदों को प्रेरित कर सकते हैं। धूल या गंदगी कण एक खंड पर उतर सकते हैं और आंशिक रूप से ब्याज के क्षेत्र(चित्रा 6D) को अस्पष्ट कर सकते हैं। छवि अधिग्रहण अपूर्ण ऑटो-कंट्रास्ट, ऑटो-फोकस और ऑटो-कलंक कार्यों के कारण विफल हो सकता है। स्वचालित रूप से बनाए गए इमेजिंग क्षेत्रों की स्थिति परिवर्तनीय हो सकती है और सभी वर्गों में आरओआई को कैप्चर करने में विफल हो सकती है।
सिलाई और संरेखण के चरण में कई समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं। मोज़ेक टाइल्स अधिग्रहण की स्वचालित सिलाई विफल हो सकती है, उदाहरण के लिए, नमूने के अंदर बड़ी खाली जगह के कारण। 3 डी में आकार में भारी परिवर्तन के कारण, छवि ढेर पंजीकरण करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। विशेष रूप से विकसित कार्यक्रम (जैसे, आईओडी, फिजी, ट्रैकेम2, एमआईबी, या मैप्स-एटी) अर्ध-स्वचालित संरेखण32,38, 39,40की सुविधा प्रदान करसकतेहैं। फोटो एडिटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अधिक चुनौतीपूर्ण अनुभागों को मैन्युअल रूप से संरेखित किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, कुछ डेटासेट सही ढंग से संरेखित करना असंभव हो सकता है।
बड़े नमूने ग्रिड पर फिटिंग TEM धारावाहिक वर्गों के लिए चुनौतीपूर्ण हैं; दूसरी ओर, कई परियोजनाएं एफआईबी/एसईएम या एसबीएफ-एसईएम का उपयोग करके लंबे समय तक स्वचालित अधिग्रहण का औचित्य साबित नहीं करती हैं। एटी एक थकाऊ धारावाहिक अनुभाग TEM के लिए एक सीधा विकल्प है जहां संग्रह और एक वेफर पर धारावाहिक वर्गों के हेरफेर स्लॉट ग्रिड के साथ की तुलना में अधिक सरल हैं । सरणी के संग्रह को सुविधाजनक बनाने के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई थीं, और हम मौजूदा टूलकिट का विस्तार करने के लिए अपनी विधि साझा करते हैं। ऐसे मामलों में जहां आरओआई की पहचान चुनौतीपूर्ण है, एटी-एसईएम नमूनों की कुशल जांच के साथ एक मौलिक लाभ प्रदान करता है, जहां 50 से 500 वर्गों में ऑर्गेनेल-स्केल संकल्प की आवश्यकता होती है। बड़ी मात्रा के लिए, यदि अधिक वर्गों की आवश्यकता होती है तो स्वचालित संग्रह एटी रणनीतियों को कुशलतापूर्वक एकत्र किया जा सकता है। एटी नमूनों को कई बार फिर से इमेज किया जा सकता है, जो पहले से प्राप्त अवलोकन छवियों के आधार पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्षेत्रों की लक्षित इमेजिंग को सुविधाजनक बनाता है। हमारा मानना है कि यहां प्रस्तावित एटी/एसईएम द्वारा लक्षित विश्लेषण और कम ओवरसैंपलिंग श्रम और डेटा भंडारण आवश्यकताओं को कम कर देता है । अंततः, वर्गों के पुस्तकालयों को एकत्र किया जा सकता है और बाद में पुन: उपयोग और परामर्श के लिए बनाए रखा जा सकता है। वॉल्यूम अधिग्रहण के लिए, एफआईबी या एसबीएफ-एसईएम दृष्टिकोण एक उत्कृष्ट समाधान प्रदान करते हैं जब भी आरओआई ब्लॉक चेहरे पर पहचानना आसान होता है या विश्लेषण के लिए बड़े 3डी वॉल्यूम की आवश्यकता होती है। हालांकि, FIB/SBF-SEM कम कुशल है जब उच्च संकल्प स्टैक छवि एक लक्षित तरीके से एक परिभाषित आरओआई से एकत्र किया जाना है । निष्कर्ष निकालने के लिए, एटी नमूनों की स्क्रीनिंग के लिए प्रस्तावित तरीके और मध्यम संकल्प अवलोकन छवियों के उपयोग से अनुभाग सरणी के प्रासंगिक हिस्सों में छवि अधिग्रहण को सीमित करने की अनुमति मिलती है। इमेजिंग क्षेत्रों का सटीक लक्ष्य समय-से-डेटा को गति देता है और डेटा मूल्यांकन को सरल बनाता है।
संक्षेप में, हालांकि एटी/एसईएम की अवधारणा उपन्यास नहीं है, इसका उपयोग अभी भी उतना व्यापक नहीं है जितना कि इसके गुण सुझाए जाएंगे । कुल मिलाकर, यह अन्य मौजूदा ईएम विधियों के लिए एक पूरक प्रक्रिया प्रदान करता है। एटी/एसईएम नमूना तैयारी प्रोटोकॉल और इमेजिंग वर्कफ्लो की व्यापक रेंज के साथ संगत है और एक साथ तकनीक के रूप में किसी भी FIB/SEM या SBF-SEM माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है । इस पेपर में, हमने उन नमूनों से अल्ट्रास्ट्रक्चरल डेटा रिकॉर्ड करने के लिए एटी पर ध्यान केंद्रित किया है जिन्हें अन्य तरीकों से सफलतापूर्वक संबोधित किए जाने की संभावना कम है। हमें उम्मीद है कि वर्गों के सुविधाजनक संग्रह और काफी स्वचालित अधिग्रहण रणनीतियों के लिए वर्णित प्रक्रिया उन लोगों के लिए पहले प्रयासों में सहायता करेगी जिन्होंने कभी विधि का सामना नहीं किया है और उन लोगों के लिए इसे सही करने में मदद करेंगे जिनके पास पहले से ही कुछ अनुभव हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम एटी प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के इस विकास के दौरान उनके समर्थन के लिए लुसाने विश्वविद्यालय के EM सुविधा के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम पांडुलिपि और महत्वपूर्ण पठन की तैयारी के दौरान चर्चाओं के लिए गैरेथ ग्रिफिथ्स, मार्टा रॉड्रिग्स, उर्सका रिपनिक, क्रिस्टन जेनाउड, हेल्मुट ग्नेगी, ईनाट Zelinger, पाओला मोरेनो-रोमन, लुसी ओ ब्रायन और लिंडसे लेवेलिन को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम उन समूहों को स्वीकार करना चाहते हैं जिन्होंने विभिन्न परिदृश्यों को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों का योगदान दिया: मैथियस लुटोल्फ, मिचेल निकोलेव, देवांजलि दत्ता, जब तक मटज़ट, और फैनी लैंगलेट।
Cutting | |||
AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
Image acquisition | |||
FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
Image analysis | |||
Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |