Vi beskriver beredningen av band av seriella sektioner och deras samling på stora överföringsstöd för användning som Array Tomography prover, tillsammans med automatiserade bildbehandling förfaranden i en scanning elektronmikroskop. Protokollet tillåter screening, hämtning och riktad avbildning av lokala, sällsynta händelser och förvärv av stora data volymer.
Elektronmikroskopi används inom biologi och medicin för avbildning av cellulära och strukturella detaljer vid nanometerupplösning. Historiskt sett har Transmission Electron Microscopy (TEM) gett insikt i cellens ultrastruktur, men under det senaste decenniet har utvecklingen av moderna scanningelektronmikroskop (SEM) förändrat sättet att se inuti cellerna. Även om upplösningen av TEM är överlägsen när proteinnivå strukturella detaljer behövs, är SEM-upplösning tillräcklig för majoriteten av organelle-nivå cellbiologi-relaterade frågor. Teknikutvecklingen möjliggjorde automatiska volymförvärvslösningar som Serial block-face imaging (SBF-SEM) och Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Men än i dag är dessa metoder ineffektiva när identifiering och navigering till intressanta områden är avgörande. Utan medel för exakt lokalisering av målområden före avbildning måste operatörerna skaffa mycket mer data än de behöver (i SBF-SEM), eller ännu värre, förbereda många rutnät och avbilda dem alla (i TEM). Vi föreslår strategin för “lateral screening” med arraytomografi i SEM, vilket underlättar lokalisering av intresseområden, följt av automatiserad avbildning av den relevanta delen av den totala provvolymen. Matristomografiprover sparas under avbildningen och kan ordnas i avsnittsbibliotek som är redo för upprepad avbildning. Flera exempel visas där lateral screening gör det möjligt för oss att analysera strukturella detaljer som är otroligt utmanande att komma åt med någon annan metod.
Trots vikten av EM-relaterade tekniker håller den ansträngning som krävs för att behärska dem hela fältet begränsat till ett litet antal specialister. En betydande svårighet är identifieringen och hämtningen av en intresseregion (ROI) i de prover som bevarats för EM. Utseendet på samma prov skiljer sig avsevärt när det analyseras av optisk mikroskopi och efter bearbetning för EM-observation. Ändringarna för kemiskt förberedda prover inkluderar anisotropa provkrympning efter uttorkningsstegen (~ 10% i varje dimension) och förlust av fluorescens vid användning av osmium i fixerings- och färgningsprotokollet(figur 1A). För ultrathinsektionen är proverna inbäddade i epoxi- eller akrylhartser med olika strategier (figur 1B). För att detta preparat ska lyckas skall hela provet fraktioneras i bitar som inte överstiger 1 mm x 1 mm. För att uppfylla standardkraven för transmissionselektronmikroskopi (TEM) är denna lilla del av provet ytterligare sektionerad till 50-150 nm tjocka skivor. De resulterande gråskalebilderna visar vävnadsorganisation och organellstruktur på en minut bråkdel av hela provet mer detaljerat än någon annan mikroskopiteknik (figur 1C). En typisk TEM-datauppsättning ger 2D-information, teoretiskt extrapolerad för att förstå de processer som förekommer naturligt i ett 3D-utrymme i celler och vävnader. Figur 1D innebär utmaningen med förvärvet av strukturella volymer: om en kub på sidan 1 000 μm är sektionerad vid 50 nm tjocklek krävs 20 000 sektioner för att täcka hela volymen; för en 500 μm sidokuk blir det 10 000 sektioner. För att täcka en volym på 50 μm x 50 μm x 50 μm kan 1 000 sektioner “endast” vara nödvändiga. Att få denna volym manuellt är praktiskt taget omöjligt och extremt utmanande att utföra med automatisering. Om vi, förutom provdjup, behöver täcka hela ytan av sådana hypotetiska kuber, blir täckningen av 1 μm2 yta vid rimlig upplösning ett allvarligt logistiskt problem (figur 1E). Även om det stora antalet avsnitt är avgörande för de extraordinära storskaliga projekten, såsom anslutningsmetoder, är det avgörande för de flesta av de “vardagliga” EM-projekten, vilket innebär en betydande nackdel att generera fler avsnitt som krävs för observationen.
Det finns flera metoder för att förvärva 3D-ultrastrukturell information: seriell sektion transmission elektronmikroskopi (TEM), TEM-tomografi, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) och Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). De viktigaste skillnaderna mellan dessa metoder är sektionsstrategin och om bildförvärvet är kopplat till avsnittsgeneration1. I seriell avsnitt TEM samlas sekventiella sektioner in på kortplatsrutnät, TEM-bilder genereras från dessa sekvenser och justeras2,3,4,5. I TEM-tomografi ger tiltserier från 150-300 nm sektioner på ett rutnät, och när de är kopplade till seriell sektionering, en mycket hög upplösning, men relativt små volymer6,7,8. AT-metoden använder fysisk sektion med olika manuella och halvautomatiska sätt för sektionsuppsamling på relativt stort stöd, till exempel glasöverdrag, kiselplattor eller ett speciellt tejp. För bildförvärv analyseras stödet i SEM, med olika bildförvärvsstrategier finnstillgängliga 9,10,11,12,13,14,15 . För SBF-SEM uppnås fysisk sektion med hjälp av en minimikrotom med en diamantkniv som är inställd direkt inuti SEM-kammaren, med SEM-bilden genererad från ytan av hartsblocket16,17,18,19. För FIB-SEM avlägsnar jonkällan tunna lager av provet, följt av automatisk avbildning av den exponerade ytan med SEM20,21. TEM-tomografi och AT genererar fysiska sektioner, som kan avbildas om det behövs, medan FSBF-SEM och FIB-SEM eliminerar avsnittet efter avbildning. En ny kombination av fysiska sektioner avbildade av en multi-beam SEM ger en kombination av metoder som löser “flaskhals” frågan om hastigheten på bildförvärv22. Var och en av dessa tekniker har revolutionerat hur EM-data kan erhållas och analyseras, och varje metod har sina praktiska effekter relaterade till en viss forskningsfråga.
Med tanke på preparatets art och de strukturella dimensionernas omfattning är det inte enkelt att förutsäga var en specifik målstruktur finns i provblocket(figur 1D,E). En lösning för ROI-lokaliseringen är att spela in bilderna från hela blocket med önskad upplösning från början. Strukturerna av intresse kan vara i den förvärvade datavolymen när de är borta från mikroskopet. Förvärvstid och datahantering i samband med denna strategi är problematiska. Det är önskvärt att minska mängden registrerade data, särskilt om ROI är mycket mindre än vävnadsblocket, dvs. om föremålen av intresse är specifika typer av celler (inte hela organ). Olika korrelativa ljus- och elektronmikroskopitekniker (CLEM) kan lyckas när fluorescensen bevaras och lokaliseras före eller efter beredningen inom samma prov23,24,25,26,27,28,29. Ändå är många cellulära strukturer igenkännliga även utan fluorescenskorrelation, endast baserat på den kända ultrastrukturen. För dessa fall tror vi att lateral screening Array Tomography ger en balans kompromiss mellan den ansträngning som investeras i ROI lokalisering och den strukturella informationskvaliteten. Med hjälp av denna strategi screenas en delmängd av sektionerna på skivan med jämna mellanrum, som kan fastställas baserat på AVKASTNINGEN storlek och natur. När roI har hittats ställs datainsamling in i en kontinuerlig serie avsnitt som börjar före och slutar efter ankarsektionen och samlar in relevant information på ett riktat sätt.
Vi presenterar protokoll för AT som förenklar och påskyndar förvärv av regioner eller händelser av intresse i många avsnitt och ger bättre anpassade bildvolymer. Sidoscreening och multistep-förvärv producerar data med mycket hög upplösning i exakt riktade regioner. Förfarandet vi beskriver tar upp flera utmaningar med 3D EM-datainsamling, eftersom det föreskriver: kompatibilitet med ett brett spektrum av exemplar utan att i grunden ändra arbetsflödet för provberedning; Riktad lokalisering för sektionering och SEM-förvärv. minskad tid och ansträngning under installationen; Bildframställning av regioner i flera sektioner med bättre anpassning av de resulterande volymerna. och en smidig sömnads- och justeringsprocedur för att sammanställa olika bilder till en sydd mosaikbild. Vi valde att visa styrkan i vår metod med flera prover från publicerade och pågående projekt. Vi tror att detta tillvägagångssätt avsevärt kan underlätta generering och förvärv av riktade EM-data, även för utredare med begränsad EM-erfarenhet.
Elektronmikroskopi ger insikt i cellernas och organismernas ultrastruktur, för vilken det ofta är önskvärt att avbilda strukturer av intresse i deras 3-dimensionella sammanhang. Trots många EM-taktiker för ultrastrukturell analys finns det fortfarande ingen “guldstandard” lösning. Den främsta orsaken är det stora utbudet av prover, många biologiska frågor, som ofta kräver ett skräddarsytt tillvägagångssätt. Det föreslagna AT-arbetsflödet är utformat för att minimera den tid som krävs för prov bearbetning, datainsamling, utvärdering och lagring. Dessutom ger den modifierade kniven ett användbart verktyg för att förenkla matrisförvärv. Den kompakta layouten av sektioner på plattor är bekväm, både för observation och efterföljande lagring av proverna. Detta arrangemang möjliggör “lateral screening” av prover genom att horisontellt flytta från band till band och skanna endast ett avsnitt på varje, vilket avsevärt minskar den tid som krävs för att lokalisera en ROI. Föreslagna scenarier för datainsamling underlättar inriktningen av små och slumpmässigt fördelade områden. När AT/SEM väl har hittats begränsar den högupplösta avbildningen exakt till den mängd av intresse som utförs manuellt eller med hjälp av automatisk funktion. AT för begränsade volymer kan slutföras manuellt, där operatören navigerar genom provet och definierar bildområden en efter en. Den automatiserade modulen i programvaran ger en flexibel bildförvärvsstrategi för avbildning av små områden på stora sektioner. Automatiseringen i denna programvara gör det möjligt att spela in stora högupplösta bilder på hundratals sektioner, vilket uppnår liknande volymer som SBFI. Att spela in översiktsbilder av alla avsnitt förenklar ROI-lokaliseringen och minskar tiden vid mikroskopet. Eftersom avsnitten inte skadas under inspelningen av översikter och förhandsversionen med högre upplösning tillåter AT/SEM återanvändning av provet för att samla in ytterligare data från andra ROM-produkter eller med högre upplösning.
Bildförvärvstid är en av de viktigaste (och dyraste) aspekterna av 3D EM och bör därför beaktas i experimentdesignen. Även om det inte är förvånande att avbildning av stora områden tar längre tid än att avbilda små områden, är det lätt att underskatta effekten: Beroende på vilka bildparametrar som valts kan förvärvstiden för varje avsnitt variera från sekunder till timmar. Kritiska bildparametrar inkluderar storleken på synfältet, upplösningen och uppehållstiden. Om man antar en målupplösning på 10nm per pixel och 1 μs uppehållstid, tar det 4 sekunder, 100 sekunder eller 2 500 μm att registrera ett fält på 20 μm x 20 μm, 100 μm x 100 μm eller 2 500 s. Vi kan multiplicera dessa bildtider per avsnitt med antalet avsnitt för att uppskatta den tid som krävs för hela bildjobbet. Långa bildtider per avsnitt kan vara acceptabla om antalet sektioner är litet eller om mikroskopverktygstiden inte är något problem.
Det är dock nödvändigt att begränsa inspelningstiden till ett nattjobb eller ett helgjobb i de flesta fall. En lika kritisk aspekt av 3D EM som bör beaktas är mängden och strukturen för de resulterande bilddata. Om du registrerar ovannämnda bildfält i 100 avsnitt genereras 400 mb, 10 gb respektive 250 gb bilddata. Bilderna på 500 μm x 500 μm utgör det ytterligare problemet med att vara större än 2 gb vardera. Många av de program som används för datautvärdering kan inte öppna bilder av denna storlek.
För att minska bildtiden är det viktigt att välja pixel uppehållstid för att uppfylla kraven på signal-till-brus-förhållande för efterföljande datautvärdering (t.ex. rekonstruktion, spårning) och begränsa inspelningarna till definierade ROI. AT-förlängningen av programvaran underlättar bildförvärv i små områden i seriella sektioner. Programvaran stöder manuella och automatiska arbetsflöden och många halvautomatiska varianter: bildområden kan placeras manuellt och fokuseras på varje avsnitt, eller användaren kan använda den automatiska sektionssökaren och positionsjusteringsfunktionerna. Beroende på vilken automatiseringsnivå som valts och stöds av exempeltypen eller bild avbildningsmålen kan den tid som krävs för att konfigurera bildförvärv i hundratals avsnitt ta en hel arbetsdag (görs manuellt) eller bara några minuter. I princip gör Array Tomography det mer utmanande än andra 3D EM-metoder att förvärva små ROIs; oprecis regionplacering på på varandra följande avsnitt måste kompenseras genom förvärv av större arealer. Om avkastningen till exempel är 20 μm x 20 μm i storlek och sektion-till-sektion-positionsvariationen för bildfält är 10 μm, måste man skaffa 40 μm x 40 μm bilder för att vara säker på att ROI är helt fångad i varje bild, på varje avsnitt. Den verkliga bildpositionsvariationen varierar från 100 μm till <10 μm beroende på tillgängligheten eller kvaliteten på programvarufunktioner för positionsjustering eller användarens tålamod. Med denna programvara kan 10 μm uppnås utan för mycket manuell intervention i de flesta prover.
Liksom alla tekniker har AT flera svaga punkter som kan påverka framgångsrikt datainsamling, och många liknar andra sektionsbaserade metoder. Brist på homogen fördelning av tomt harts kontra vävnad kan resultera i böjda eller trasiga matriser. I extrema fall kan sektioner lossna från stödet (figur 6A). Variabel komprimering eller sträckning under skärprocessen kan skapa veck som kan störa provet i variabla områden på efterföljande sektioner (bild 6B). Knivmärken kan förekomma på ytan av de insamlade sektionerna med en skadad kniv (figur 6C). Skillnader i sektionsförhållanden kan inducera tillfälliga sektionskomprimerings- och tjockleksskillnader. Damm- eller smutspartiklar kan landa på en sektion och delvis skymma intressezonen(figur 6D). Bildförvärv kan misslyckas på grund av ofullständiga funktioner för automatisk kontrast, autofokus och auto-stigmator. Placeringen av automatiskt skapade bildområden kan vara variabel och kan misslyckas med att fånga avkastningen i alla avsnitt.
Flera problem kan uppstå vid söm- och inriktningsstadiet. Den automatiska sömmen av mosaikplattor förvärv kan misslyckas, till exempel på grund av det stora tomma utrymmet inuti provet. På grund av en drastisk förändring i form i 3D kan bildstackar vara utmanande att registrera sig. Specialutvecklade program (t.ex. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB eller MAPS-AT) kan underlätta halvautomatisk inriktning32,38,39,40. Mer utmanande avsnitt kan justeras manuellt med hjälp av fotoredigeringsprogram. Tyvärr kan vissa data uppsättningar vara omöjliga att justera korrekt.
Stora prover är utmanande för TEM-seriella sektioner som monteras på rutnät. Å andra sidan motiverar många projekt inte ett långt automatiskt förvärv med FIB/SEM eller SBF-SEM. AT är ett enkelt alternativ till en tråkig seriesektion TEM där insamling och manipulering av seriella sektioner på en wafer är enklare än med slitsrutnäten. Flera strategier utvecklades för att underlätta insamlingen av matriserna, och vi delar vår metod för att utöka den befintliga verktygslådan. I de fall där identifieringen av roi är utmanande ger AT-SEM en grundläggande fördel, med effektiv screening av proverna där organellskalans upplösning krävs över 50 till 500 sektioner. För större volymer kan de automatiska insamlings-AT-strategierna samlas in effektivt om fler avsnitt krävs. AT-prover kan avbildas flera gånger, vilket underlättar riktad avbildning av högupplösta områden baserat på tidigare förvärvade översiktsbilder. Vi tror att den riktade analysen och den minskade översamplingen av AT/SEM som föreslås här minskar arbets- och datalagringskraven. I slutändan kan bibliotek med sektioner samlas in och underhållas för senare återanvändning och samråd. För volymförvärv erbjuder FIB- eller SBF-SEM-metoder en utmärkt lösning när avkastningen är lätt att identifiera på blockytan eller om stora 3D-volymer behövs för analysen. FIB/SBF-SEM är dock mindre effektiva när den högupplösta stackbilden måste samlas in från en definierad ROI på ett riktat sätt. Sammanfattningsvis gör de föreslagna metoderna för screening av AT-prover och användningen av bilder med medelupplösningsöversikt det möjligt att begränsa bildförvärvet till de relevanta delarna av avsnittsmatrisen. Exakt mål för bildregioner påskyndar tid till data och förenklar datautvärderingen.
Sammanfattningsvis, även om begreppet AT/SEM inte är nytt, är dess användning fortfarande inte så utbredd som dess fördelar skulle antyda. På det hela taget ger det ett kompletterande förfarande till andra befintliga EM-metoder. AT/SEM är kompatibel med det bredaste utbudet av provberedningsprotokoll och bildarbetsflöden och kan göras på alla FIB/SEM- eller SBF-SEM-mikroskop som en medföljande teknik. I det här dokumentet har vi koncentrerat oss på AT för att registrera strukturella data från prover som är mindre benägna att hanteras framgångsrikt med andra metoder. Vi hoppas att det beskrivna förfarandet för bekväm insamling av sektioner och avsevärt automatiserade förvärvsstrategier kommer att hjälpa till i de första försöken för dem som aldrig har stött på metoden och kommer att bidra till att fullända den för dem som redan har viss erfarenhet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka medlemmarna i EM-anläggningen vid universitetet i Lausanne för deras stöd under denna utveckling av olika steg i AT-förfarandet. Vi vill tacka Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O’Brien och Lindsay Lewellyn för diskussioner under utarbetandet av manuskriptet och kritisk läsning. Vi vill uppmärksamma de grupper som bidrog med de prover som användes för att demonstrera de olika scenarierna: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat och Fanny Langlet.
Cutting | |||
AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
Image acquisition | |||
FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
Image analysis | |||
Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |