हमने एंटेग्रेड परफ्यूजन तकनीक द्वारा उच्च गुणवत्ता वाले व्यक्तिगत माउस हृदय कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरलई विधि विकसित की है। यह विधि लैंगेंडोर्फ-मुक्त है और वेंट्रिकुलर और एट्रियल मायोसाइट्स या इंटरस्टिटियल कोशिकाओं, जैसे कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट या जनक को अलग करने के लिए उपयोगी है।
माउस दिल का उपयोग कर बुनियादी अनुसंधान में, व्यवहार्य व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना एक महत्वपूर्ण तकनीकी कदम है। परंपरागत रूप से, खरगोशों, गिनी सूअरों या चूहों से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना लैंडेनडोर्फ उपकरण का उपयोग करके एंजाइमों के साथ दिल के प्रतिगामी पर्फ्यूजन के माध्यम से किया गया है। हालांकि, जब इस विधि का उपयोग छोटे माउस दिल के साथ किया जाता है तो उच्च स्तर के कौशल की आवश्यकता होती है। एक एंटेग्रेड परफ्यूजन विधि जो लैंगेंडोर्फ उपकरण का उपयोग नहीं करती है, हाल ही में माउस कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए सूचित किया गया था। हम यहां वयस्क चूहों (8 – 108 सप्ताह पुराने) से व्यक्तिगत हृदय कोशिकाओं को अलग करने के लिए उत्पादित दिल के बेहतर एंटेग्रेड परफ्यूजन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। एंटेग्रेड परफ्यूजन उत्पादित दिल के बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के पास परफ्यूसेट इंजेक्शन द्वारा किया जाता है, जिसका महाधमनी एक जलसेक पंप का उपयोग करके दबाया गया था। सभी प्रक्रियाएं माइक्रोस्कोप के नीचे पूर्व-गर्म हीटर चटाई पर की जाती हैं, जो इंजेक्शन और पर्फ्यूजन प्रक्रियाओं की निगरानी करने की अनुमति देती है। परिणाम बताते हैं कि वेंट्रिकुलर और एट्रियल मायोसाइट्स, और फाइब्रोब्लास्ट को एक साथ एक वयस्क माउस से अच्छी तरह से अलग किया जा सकता है।
आम तौर पर, विच्छेदित ऊतकों के एकल कोशिका अलगाव के पहले चरण में ऊतक को छोटे टुकड़ों में नख़रे जाने में शामिल होता है, जिसके बाद एंजाइमों के साथ संयोजी ऊतक और बाह्राश मैट्रिक्स का पाचन होता है। हालांकि, कार्डियोमायोसाइट्स को इस तरह के चॉपिंग विधि से अलग नहीं किया जा सकता है, क्योंकि कोलेजन और इलास्टिन फाइबर सहित एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स घटकों के साथ संवर्धन, मायोकार्डियम को कीमा बनाने के लिए बहुत कठिन बनाता है, और कार्डियोमायोसाइट्स हाइपोक्सिया और माइक्रोएनवायरमेंट में अन्य बदलावों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं। इस प्रकार, लैंगेंडोर्फ आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन सिस्टम1का उपयोग करके, एंजाइमों के साथ एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स को पचाने की एक विधि विकसित की गई हैताकि हृदय2,3,4से अलग-अलग कार्डियोमायोसाइट्स को अलग किया जा सके।
माउस मॉडल में, एंजाइमों के साथ दिल के लैंगेंडोर्फ आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन का उपयोग व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स5,6,7,8के अलगाव के लिए भी कियाजाताहै। हालांकि, छोटे और पतले माउस महाधमनी के कैनुलेशन और प्रतिगामी परफ्यूजन करने के लिए लैंगेंडोर्फ उपकरण पर इसके बढ़ते कौशल की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है, क्योंकि वयस्क दिल में महाधमनी का व्यास लगभग 1.2 मिमी है। इसके अलावा, कई प्रयोग करने में समय लगता है क्योंकि लैंगेंडोर्फ उपकरण को अगले दिल को छिद्रित करने से पहले साफ किया जाना चाहिए।
प्रतिगामी परफ्यूजन के विकल्प के रूप में, लैंगेंडोर्फ उपकरण के बिना वयस्क माउस हार्ट से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक उपन्यास विधि विकसित की गई थी। यह युग बनाने की विधि कोरोनरी धमनियों9के एंटेग्रेड परफ्यूजन पर आधारित थी । हमने हाल ही में इस एंटेग्रेड प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में सुधार किया है, जैसे कि महाधमनी, सुई प्रविष्टि और तापमान नियंत्रण का क्लैंपिंग, और माइक्रोस्कोप10के साथ सभी पर्फ्यूजन प्रक्रियाओं की निगरानी की। हम इसमें अलगाव के लिए समय को छोटा करने और एक पूरक वीडियो प्रदान करने के लिए इस एंटीग्रेड परफ्यूजन विधि के शोधन को विस्तार से रिपोर्ट करते हैं। इस विधि में, दिल का पर्फ्यूजन एंजाइमों के 10 एमएल के साथ लगभग 7 मिनट लेता है, और यह छोटा पाचन अवधि कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बढ़ाती है। यह 2,3-ब्यूनएक मोनोक्सीम (बीडीएम)6,11 या टॉरिन5,8जैसे रसायनों के अलावा की आवश्यकता के बिना उच्च गुणवत्ता पर एकल हृदय कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल तरीका है। हमारा मानना है कि यह विधि तकनीक की कौशल सीमा को कम करेगी और बुनियादी शोध में माउस कार्डियोमायोसाइट्स की उपयोगिता को बढ़ाएगी।
चूंकि दिल इस्केमिया के लिए अतिसंवेदनशील होता है, इसलिए संकुचन को रोकने के लिए इसे बर्फ-ठंडे सीआईबी-ईजीटीए में विसर्जित करने के लिए लिया गया समय (<1 मिनट) कम रखा जाना चाहिए। यह इस विधि का पहला महत्वपूर्ण कदम है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम दिल की दिशा से संबंधित है। चरण 2.1.2 में उत्पादित दिल का विशेष अभिविन्यास महाधमनी के चारों ओर वसा और संयोजी ऊतकों को देखना और हटाना आसान बनाता है। महाधमनी के चारों ओर सफाई करने के बाद, पर्फ्यूजन प्लेट पर पूर्वकाल सतह की ओर के साथ क्लैंप किए गए दिल को रखें। अंतिम महत्वपूर्ण कदम इंजेक्शन सुई के सम्मिलन शामिल है। सुई को दिल की ओर आगे बढ़ाते समय, इंजेक्शन सुई को प्लेट से निरंतर दूरी बनाए रखने के लिए परफ्यूजन प्लेट से अलग नहीं किया जाना चाहिए। प्रविष्टि की स्थिति बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के पास है। घुमा के बिना ध्यान से सुई डालें, क्योंकि इस तरह के घुमा छेद बड़ा हो सकता है। लाल निशान देखकर सुई के सम्मिलन की गहराई का अनुमान लगाया जा सकता है। यदि सुई बहुत गहरी डाली जाती है, तो टिप वेंट्रिकुलर सेप्टम के माध्यम से छेद सकती है और दाएं वाल्व में प्रवेश कर सकती है और बाएं एट्रियम में प्रवेश कर सकती है। कोरोनरी धमनी से रक्त के गायब होने की पुष्टि के बाद, सुई को टेप से परफ्यूजन प्लेट में तय किया जाना चाहिए।
एक लंबी महाधमनी लंबाई सही स्थिति में महाधमनी को दबाना मुश्किल बना देती है। यदि क्लैंप अटरिया से बहुत दूर है, तो दिल जलसेक के बाद घुमा सकता है। इसे रोकने के लिए, क्लैंपिंग से पहले महाधमनी को छोटा करने के लिए ब्रैकिओसेफेलिक धमनी के ठीक नीचे महाधमनी को काट लें।
यदि 05 एमएल/मिनट की प्रारंभिक गति से परफ्यूजन के बाद रक्त का निर्वहन शुरू नहीं होता है, तो गति को 1 एमएल/मिनट तक बढ़ाएं। यदि इससे मदद नहीं मिलती है, तो इंजेक्शन सुई को गलत तरीके से तैनात किया जा सकता है, जैसे कि दाएं वेंट्रिकल, वेंट्रिकुलर सेप्टम या बाएं मायोकार्डियल दीवार में। ऐसे में सुई को तुरंत हटा दें और बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष के पास इसे फिर से डालने की कोशिश करें। सुई को कई बार डालने पर, पचाने वाली कोशिकाएं खुले छेदों से बाहर निकल सकती हैं। ध्यान दें कि यह आमतौर पर कोशिका अलगाव को गंभीर रूप से प्रभावित नहीं करता है।
ऑपरेटर रंग और पारदर्शिता में परिवर्तन और पाचन के साथ अटरिया की धड़कन को फिर से शुरू करने के लिए स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दिल के एंटीग्रेड परफ्यूजन की पूरी प्रक्रिया की निगरानी कर सकते हैं। एंजाइम मिश्रण के कुल 10 मिलील अधिकतम आवश्यक होना चाहिए, यहां तक कि एक पुराने दिल के लिए भी। छोटे दिलों (5-7 सप्ताह पुराने) में, हम मात्रा को 9 एमएल तक कम करते हैं, जो एक ही एंजाइम मिश्रण के साथ प्रतिगामी परफ्यूजन के माध्यम से दृष्टिकोण के समान है।
अंतिम अपकेंद्रित्र पर सुपरनेट में मलबे, रक्त कोशिकाओं और गैर-मायोसाइट्स होते हैं जबकि, गोली में मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं और फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे गैर-मायोसाइट्स को दूषित करते हैं। कार्डियोमायोसाइट्स को शुद्ध करने के लिए, और अधिक कदम की आवश्यकता है। सामान्य तौर पर, गोली को उपयुक्त सेल संस्कृति माध्यम में फिर से निलंबित किया जाना चाहिए और ऊतक सेल कल्चर डिश पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रीप्लाट किया जाना चाहिए, और फिर धीरे-धीरे संस्कृति के लिए पाइपिंग और प्रीपलेटिंग द्वारा कार्डियोमायोसाइट्स को हटा दें।
एंजाइम मिश्रण में सीए2 + (0.3 mM) की कम एकाग्रता होती है। इसलिए हम कोशिका पुनःपिण समाधान (1.8 m M Ca2+)के साथ अंतिम पुनः प्राप्त होने से पहले सीआईबी-सीए2 +में पचा कोशिकाओं को इनक्यूबेट करते हैं, और सीए2 + में क्रमिक वृद्धि सेल क्षति7के कारण से बचता है। जब तक अलग कार्डियोमायोसाइट्स बरकरार हैं (कोई संकुचन के साथ शांत कोशिकाओं) इस Ca2 +अनुकूल प्रक्रिया चूहों में कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है । चूंकि इस इनक्यूबेशन के दौरान क्षतिग्रस्त कोशिकाएं मर रही हैं, इसलिए हम फलस्वरूप एक स्वस्थ कोशिका समूह प्राप्त करते हैं। इसी तरह, अलग अक्षुण्ण एट्रियल मायोसाइट्स (अनियमित संकुचन के बिना शांत कोशिकाओं) को एक ही कोशिका पुनः प्राप्त करने के समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, एट्रियल मायोसाइट्स वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की तुलना में संग्रहीत होने के लिए अधिक नाजुक होते हैं।
प्रयोगशाला में, यह अलगाव विधि लगभग हमेशा सफल होती है जब तक कि बाईं वेंट्रिकल में सुई सम्मिलन विफल न हो जाए। हम सर्जिकल ट्रांसवर्स महाधमनी कसना द्वारा तैयार हाइपरट्रोफिड दिल से कोशिकाओं को अलग करने में भी सफल रहे हैं। हालांकि, वृद्ध चूहों में, जिनमें अक्सर छोटे मायोकार्डियल इंफेक्शन होते हैं, कुछ स्थानों पर परफ्यूजन बंद हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अधूरा पाचन होता है और इस प्रकार लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रतिगामी विधि के समान कम उपज(चित्रा 1 सी)होती है। ऐसे मामलों में, परफ्यूजन की शुरुआत में भी दिल की विकृत आकृति देखी जा सकती है।
यह एंटेग्रेड परफ्यूजन विधि विभिन्न उम्र के चूहों से दिल की कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोगी है, लेकिन खरगोश और गिनी सूअरों जैसे बड़े जानवर नहीं हैं। इस विधि को प्रात: यनात से पहले नवजात या किशोर चूहों पर लगाना संभव हो सकता है।
इस एंटीग्रेड परफ्यूजन विधि के फायदों में से एक यह है कि यह छोटे माउस दिलों के लिए लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन विधि का उपयोग करने से जुड़ी तकनीकी बाधाओं को कम करता है। परफ्यूजन के लिए आवश्यक समय एंजाइमों के 10 एमएल के साथ लगभग 7 मिनट है, यह छोटा पाचन अवधि कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बढ़ाती है। इसके अलावा, यह महाधमनी वाल्व पचाने के बाद भी हृदय के कोरोनरी परिसंचरण के माध्यम से किया जा करने के लिए पर्फ्यूजन सक्षम बनाता है। एट्रियल मायोसाइट्स के अलगाव के लिए आमतौर पर लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन औरएंजाइमों 17के साथ आगे इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। हालांकि, यह एंटेग्रेड परफ्यूजन दृष्टिकोण, एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए एंजाइम के साथ ऊतक को गहराई से व्याप्त कर सकता है।
कई चूहों का उपयोग कर प्रयोगों में, लैंगेंडोर्फ उपकरण को अगले दिल को छिद्रित करने से पहले साफ किया जाना चाहिए। हालांकि, वर्तमान एंटेग्रेड विधि में, जब तक वांछित संख्या में उपकरण सेट (उदाहरण के लिए, सीरिंज सुई और परफ्यूजन प्लेटें) पहले से तैयार किए जाते हैं, परफ्यूजन लगातार किया जा सकता है।
हम इसके साथ ही लैंगेंडोर्फ-आधारित प्रतिगामी परफ्यूजन विधि के समान समाधानों का उपयोग करके माउस दिल के एंटीग्रेड परफ्यूजन की बुनियादी पद्धति की रिपोर्ट करते हैं जिसमें कोई अतिरिक्त रसायन नहीं है। प्रयोग के उद्देश्य के अनुरूप परफ्यूसेट की संरचना को बदला जा सकता है, जैसे कि एंजाइमों के बजाय ईजीटीए युक्त डिटर्जेंट का उपयोग करना 18 को डिसेलुलराइज्ड हार्ट18बनाने के लिए।
The authors have nothing to disclose.
लेखक मॉर्फोलॉजिक प्रयोगों में उनकी सहायता के लिए टी यामामोटो और वाई मोरी का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (18K06871 से एमओके और 17K08536 से एच.M) तक ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) द्वारा समर्थित किया गया था।
Amphotericin B | Wako Pure Chemical Industries, Japan | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes, USA | A11001 | Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-α-actinin (ACTN) | Sigma-Aldrich, USA | A7811 | Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining) |
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP) | Merck-Millipore, USA | AB5490-I | Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots) |
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Cell Signaling Technology, USA | 2118 | Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
Anti-smooth muscle actin (SMA) | Dako, Denmark | M0851 | Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining) |
Anti-rabbit IgG antibody | Amersham, GE Healthcare, USA | NA934 | Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots) |
ATP disodium salt | Sigma-Aldrich, USA | A26209 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A9418 | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Biological material for adhesion of the cell or tissues |
Chemi-Lumi One Super | Nacalai Tesque, Japan | 02230-14 | Chemiluminescent reagent used for western blotting. |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemicals, USA | LS004176 | Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg. |
Complete Mini | Roche, Germany | 11836153001 | A mixture of several protease inhibitors. |
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Nacalai Tesque, Japan | 11034-56 | Used for cell-impermeant nuclear stainig |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Nacalai Tesque, Japan | 08458-45 | including 4.5 g/L gluose |
Extension tube | Top, Japan | X1-50 | Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion. |
EPC-8 patch-clamp amplifier | HEKA, Germany | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, USA | F7524-500ML | |
Glass capillaries | Narishige Scientific Instrument Lab., Japan | outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm | |
GTP lithium salt | Sigma-Aldrich, USA | G5884 | |
Horizontal microelectrode puller | Germany) | P-97 | |
Heater mat | Natsume Seisakusho, Japan | KN-475-3-40 | Equipment to warm the perfusion plate. |
Infusion pump | TERUMO, Japan | TE-311 | Infusion syringe pump for antegrade perfusion. |
Injeciton needle (27 gauge) | TERUMO, Japan | NN-2719S | Needle for insertion into the left ventricle. |
Insulin (from bovine pancrease) | Sigma-Aldrich, USA | I5500 | Dissolve in 0.1 M HCl. |
Mini cordless grinder | Funakoshi, Japan | cG-4A | Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube. |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA) | Nacalai Tesque, Japan | 09154-85 | |
Penicillin G potassium | Nacalai Tesque, Japan | 26239-84 | |
Phenol Red | Nacalai Tesque, Japan | 26807-21 | |
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS) | Nacalai Tesque, Japan | 27575-31 | |
Plastic multi-well culture plate | Falcon, USA | 353226 | Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate. |
Plastic syringe (20 mL) | TERUMO, Japan | SS-20ES | Use for infusion of CIB-EGTA. |
Plastic syringe (30 mL) | TERUMO, Japan | SS-30ES | Use for infusion of Enzyme-mix |
Plastic transfer pipette | Sarstedt, Germany | 86.1171 | Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette. |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck-Millipore, USA | IPVH00010 | Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting) |
Protease | Sigma-Aldrich, USA | P5147 | A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease. |
4X Sample buffer solution | Fuji Film, Japan | 198-13282 | Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB |
SDS polyacrylamide gel (15%) | Fuji Film, Japan | 193-14991 | |
Streptomycin sulfate | Nacalai Tesque, Japan | 32237-14 | |
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG) | Nacalai Tesque, Japan | 09422-81 | Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3) |
Trypsin | Sigma-Aldrich, USA | T8003 | Trypsin from bovine Type 1. |
Vascular clamp | Karl Hammacher GmbH, Germany | HSE 004-35 | Small straight vascular clamp used for clamping aorta. |
All other reagents | Nacalai Tesque, Japan |