Summary
ここでは、ショウ ジョウバエ の雄性生殖巣の後期胚をライブイメージングするために必要な解剖プロトコルを提供する。このプロトコールは、通常の条件下で、またはトランスジェニックまたは薬理学的操作後の動的細胞プロセスの観察を可能にする。
Abstract
ショウジョウバエメラノガスター雄胚性生殖巣は、生殖細胞発生、piRNA生物学、およびニッチ形成を含むがこれらに限定されない発生生物学の様々な側面を研究するのに有利なモデルである。ここでは、生体内ライブイメージングが非常に効果のない期間に、生体外で生殖巣をライブイメージングする解剖技術を提示する。このプロトコルは、胚をイメージング皿に移し、適切に段階的に配列された雄胚を選択し、その構造的完全性を維持しながら周囲の組織から生殖腺を解剖する方法を概説する。解剖に続いて、生殖巣を共焦点顕微鏡を用いて画像化し、動的な細胞プロセスを視覚化することができる。解剖手順には正確なタイミングと器用さが必要ですが、一般的な間違いを防ぐ方法とこれらの課題を克服する方法についての洞察を提供します。我々の知る限り、これはショウジョウバエの胚性生殖腺の最初の解剖プロトコルであり、そうでなければアクセスできない時間枠の間にライブイメージングを可能にするでしょう。この技術は、薬理学的または細胞型特異的トランスジェニック操作と組み合わせて、天然の生殖腺環境において細胞内または細胞間で起こる動的プロセスを研究することができる。
Introduction
ショウジョウバエのメラノガスター精巣は、多くの動的な細胞プロセスの理解のためのパラダイムとして役立ってきました。このモデルの研究は、幹細胞分裂制御1,2,3、生殖細胞発生4,5、piRNA生物学6、7、8、およびニッチ幹細胞シグナル伝達事象9、10、11、12、13に光を当てた。このモデルは遺伝的に扱いやすいため有利です14,15,そして自然環境で幹細胞をライブイメージングできる数少ないものの1つです3,16,17,18。しかし、このモデルのライブイメージングは成体組織と初期胚期に限定されており、ニッチが最初に形成され機能し始めている正確な段階である後期胚の生殖腺動態に関する知識にギャップを残しています。
後期胚性生殖巣は球体であり、前部の体細胞ニッチ細胞と、より後方領域19全体にわたって体性生殖腺細胞によって嚢胞された生殖細胞とからなる。この器官は、初期段階17から17、20、21の初期胚までインビボで生きて画像化することができる。さらに、大規模な筋肉収縮の開始により画像化が妨げられる。これらの収縮は非常に深刻で、生殖腺を画像フレームから押し出すため、そのような動きは画像化ソフトウェアでは補正できません。私たちの研究室では、ライブイメージングのためのこのとらえどころのない時期に起こるニッチ形成のメカニズムを明らかにすることに興味を持っています。そこで、胚期16から生殖巣を生きた画像化するエクスビボアプローチを生かし、生殖腺発生のこの重要な時期における細胞ダイナミクスの研究を促進しました。私たちの研究室の以前の研究は、このex vivoイメージングがin vivo生殖腺発達を忠実に再現することを示しています17。この技術は、ショウジョウバエの胚性生殖腺にとってその種の最初で唯一のものです。
ここでは、後期胚期における生殖巣のエクスビボライブイメージングに必要な解剖プロトコルを提示する。このプロトコールは、薬理学的処置、または生殖腺内の特定の細胞系譜のトランスジェニック操作と組み合わせることができる。この技術を用いて、幹細胞ニッチ形成17のステップを画像化することに成功した。したがって、このイメージングアプローチは、自然環境内でニッチ形成の初期段階をリアルタイムで視覚化できるため、幹細胞生物学の分野にとって有益です15,17。この方法は幹細胞生物学の分野にとって有益であるが、細胞再配列22、細胞接着2、12、23、および細胞遊走23を含む、この発生時点の間に生殖腺で起こる任意の動的プロセスを視覚化するためにさらに適用可能である。したがって、この解剖プロトコルは、多くの基本的な細胞生物学的プロセスに関する私たちの理解を深めるでしょう。
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Protocol
1. 解剖前日の準備
- 得られた直径が約0.03mmとなるようにタングステン針24 を電解的に鋭くする。供給電圧を約14Vに調整し、3.3MのNaOHを使用してください。シャープニングには1〜2分しかかかりません。
注意:NaOHは非常に腐食性があり、皮膚と接触すると火傷を引き起こします。取り扱い中は手袋とゴーグルを着用し、ヒュームフード内で作業してください。
注:使用後は、NaOHをポリプロピレン製のファルコンチューブに保管してください。 - 準備した撮像媒体を作る。15 mL の円錐管で、4.25 mL のシュナイダー培地を 750 μL のウシ胎児血清 (FBS、最終濃度 15%)および 27.5 μL のペニシリン-ストレプトマイシン (0.05 U/μL のペニシリン、0.05 μg/μL の最終濃度) と組み合わせます。この調製した撮像媒体を4°Cで保存する。
- ヘプタン接着剤溶液を作る。約20 cmの両面テープで詰めた20 mLの密封可能なバイアルに約0.5 mLのヘプタンを加える。ヌテーターを約1時間揺らすか、水とグリセロールの一貫性が達成されるまでピペットチップで攪拌します。溶解した接着剤のこの溶液は、ヘプタンが蒸発する前に数日間持続する。溶液を新鮮にするために、さらに0.5mLのヘプタンを加え、そして岩を加える。
注:効果的なヘプタン接着剤溶液は、テープに対するヘプタンの様々な比率、ならびに様々なロッキング/攪拌の持続時間を使用して調製することができる。上記の仕様は、そのような適切な解決策の1つを調製または新鮮化するための単なる提案である。
2. 胚採取—解剖の15~17時間前
- りんご果寒天プレート25に新鮮な酵母ペーストを加える。小さな穴26で穿孔された空の食物瓶に成虫のハエ(生後10日未満)を加えて胚採取ケージを設置する。酵母寒天プレートを用いて収集ケージに蓋をし、ボトルにテープを貼り、プレート側を下にしてケージを25°Cの暗所インキュベーター内に1時間置いた。
注:ハエは、胚の解剖が実体蛍光顕微鏡下で行われるため、生殖巣を蛍光的にマークする導入遺伝子、例えば six4-eGFP::Moesin20を発現しなければならない。生殖腺をマークするために使用される遺伝子型のリストについては、 材料表 を参照してください。 - インキュベーターからケージを取り出し、この最初のコレクションを捨てます。それを新しく酵母たての寒天プレートと交換し、ケージをインキュベーターに2時間戻します。
注:最初の胚収集は、受精し、発達中の胚の雌をクリアし、タイトなタイミングの胚の第2の収集を達成するために使用される。 - 寒天プレートをケージから取り出し、密封可能なプラスチック容器内の湿ったペーパータオルの上に(酵母の側を上に向けて)置きます。この湿ったチャンバーを25°Cのインキュベーターに入れ、胚を14.5時間熟成させます(最終年齢、産卵後14.5〜16.5時間)。
メモ: 手順 2.4 を開始する直前に、手順 3.1 および 3.2 を完了します。 - 寒天プレートをインキュベーターから取り出し、ホヤボトルを使用して、寒天プレートに十分な水を加え、ペイントブラシで軽くブラッシングして酵母ペーストを溶解させる。胚をすすぎ、酵母を計量ボートの中に置かれた小さなメッシュスクリーンバスケットに溶かします。ほとんどの酵母ペーストがメッシュを通してろ過されるまで、水ホヤボトルでバスケットをすすいでください。
- 計量ボートから水を取り除き、バスケットを中に入れ直します。胚を50%漂白剤溶液に浸すことによって胚を脱絨毛し、ホヤ瓶を使用する。漂白剤溶液の深さは3〜5mmでなければなりません。胚を漂白剤に沈めて約2分間保ち、時折渦巻く。
警告: 漂白剤は腐食性があり、目や気道を刺激したり損傷させたりする可能性があります。漂白剤を取り扱うときは、手袋とゴーグルを着用してください。
メモ: この間、ステップ 3.3 のできるだけ多くを完了して下さい。脱絨毛の進行は、バスケットを実体顕微鏡下に置き、背側付属器がないかどうかを確認することによって確認することができる。必要に応じて、胚を漂白剤溶液にさらに時間沈める。 - 漂白剤を捨て、バスケット内の胚をホヤ瓶の水で徹底的にすすいでください(約3秒間、メッシュバスケットをペーパータオルで吸い取り、2〜3回繰り返します)。
3. 解剖日の準備
- 1.5 mL エッペンドルフチューブ (最終濃度 0.2 mg/mL) で 1,500 μL 調製したイメージング培地 (ステップ 1.2 を参照) に 30 μL インスリン (10 mg/mL) を追加します。よく混ぜ合わせ、チューブをベンチトップに残して室温まで平衡化します。
- 接着剤でコーティングされたカバースリップストリップを準備します。
- ダイヤモンドの先端を持つナイフを使用して、22 mm x 22 mmのカバースリップを4つの同じサイズのストリップに切ります(図1A)。
- 鉗子を使用してストリップを1つ拾い上げ、合計約30μLのヘプタン接着剤溶液をストリップの両側に広げます(図1B)。接着剤残渣の均一な層を達成するには、ヘプタンが蒸発している間にストリップを様々な角度で傾ける。
- 接着剤で覆われたストリップをカバースリップボックスの空のスロットに保管してください。粘着性を維持するには、ストリップを斜めに、しかし直立した位置に置き、箱の端にもたれかかって箱の表面との接触を最小限に抑えます(図1C)。空気中の微粒子が接着剤をコーティングし、その粘着性を軽減しないように箱を閉じます。
- ベンチトップに次のアイテムを置きます:6インチガラスパスツールピペット、顕微鏡スライド、適切なピペットチップを備えたP200およびP1000ピペットマン、リンゲル溶液27 (NaOHでpHを7.3に調整)、および覆われていないPoly-D-リジンコーティングされた35mmイメージングディッシュ。
- メッシュスクリーンバスケットから、500~750μLのヘプタンで満たされた小さな時計皿に胚を移す。
- バスケットの側面と底をティッシュワイプで乾かします。絵筆をヘプタンで湿らせ、絵筆を胚に触れ(疎水性ビテリン膜が剛毛に付着するはずです)、絵筆を時計皿のヘプタンに戻します(胚は下に沈むはずです)。
注:胚が乾燥するのを防ぐために、次のステップをできるだけ早く実行する必要があります。胚は20秒以上空気に曝されるべきではありません。
- バスケットの側面と底をティッシュワイプで乾かします。絵筆をヘプタンで湿らせ、絵筆を胚に触れ(疎水性ビテリン膜が剛毛に付着するはずです)、絵筆を時計皿のヘプタンに戻します(胚は下に沈むはずです)。
- パスツールピペットを用いて胚を顕微鏡スライド上に移す(図1D)。胚をゆっくりとピペットに引き込み、ピペットの狭い部分に制限します。ピペットの胚はゆっくりとスライド上に形成され、スライドに流れる前にピペットの先端のすぐ内側に凝集します。ティッシュワイプの角を細かい先端にねじり、スライド上の胚からヘプタンを吸い取ります。それらは集約され、より小さな領域をカバーするため、次のステップで接着剤で覆われたストリップにそれらをキャプチャすることが容易になります。
- 鉗子で、接着剤で覆われたストリップを拾い上げ、それを胚にそっと触れます(図1E)。ストリップを画像化皿に置き、胚をサイドアップし、Poly-D-リジンコーティングされた中心のすぐ外側に置きます。鉗子を使用してストリップを皿に押し付け、所定の位置に固定されていることを確認します。直ちに2〜3.5mLのリンゲル溶液で皿を浸す。胚が乾燥するのを防ぐために、最初に胚を沈めます(図1F)。
4. 解剖
メモ:これらの手順は、実体蛍光顕微鏡下で実行する必要があります。
- 10〜15個の胚をデビテリン化する。
注:これは、初心者のための2つの胚から、専門家のための15個の胚まで及ぶかもしれません。- 腸の形態に基づいてステージ16の胚を選択します(図2)。この段階では、胚には3つの腸狭窄があり、4つの積み重ねられた腸セグメントを作り出します(図2 B、B ')。デビテル化を開始するには、選択した胚をタングステン針で一端、好ましくは前部に突き刺す。胚はそのビテリン膜から飛び出すことがありますが、そうでない場合は、胚から膜を剥がします。
注:解剖するには若すぎる胚は、非局所化された腸を有する(図2C)。ステージ17胚の解剖は可能であるが、キューティクルがこの段階で発達し始めているため、ステージ16胚の解剖よりも困難である。初期段階17胚は、互いに相対的にシフトした4つの腸管セグメントを有する(図2D,D ́)。 - 生殖腺から遠く離れた領域の胚に針を引っ掛ける。引っ掛けられた胚を皿のポリリジンコーティング領域(ここ以降は単に「カバースリップ」と呼ばれる)に移し、それが付着するまで底にドラッグする。これらのステップを繰り返し、ポリリジンコーティングされたカバースリップの上部に沿って一列にデビテリン化胚を配置し(図3A)、さらなる解剖のために下に十分なスペースを残します。
注:生殖巣は、使用される特定のマーカーおよび導入遺伝子のコピー数に応じて、明るく蛍光を発するはずの細胞の小さな球状の凝集体として現れる。この段階では、生殖腺はセグメントA5において横方向に位置し、前部からの胚長の約70%〜80%に位置する。解剖プロトコル全体を通して、組織は針にくっつくことがあります。針から破片を取り除くには、リンガーの溶液の表面のすぐ上に持ち上げます。デビテリン化は、生殖腺の適切なものができるだけ乱されない限り、乱れにくいことがあります。
- 腸の形態に基づいてステージ16の胚を選択します(図2)。この段階では、胚には3つの腸狭窄があり、4つの積み重ねられた腸セグメントを作り出します(図2 B、B ')。デビテル化を開始するには、選択した胚をタングステン針で一端、好ましくは前部に突き刺す。胚はそのビテリン膜から飛び出すことがありますが、そうでない場合は、胚から膜を剥がします。
- 生殖腺を胚から取り出して皿にフィネスします(図3C、D)。
- まず、胚をファイリングしてその内部を露出させます(図3C)。胚をその中心からスライスし、針を後方に、生殖腺の間で移動させる。これは外部のキューティクルよりもはるかによく皿にくっつくので、いくつかの内部組織をからかいます。組織の粘着性は、生殖腺を明らかにし、それがカバースリップに付着することを可能にする次の操作を可能にする。
注:組織が皿に付着していない場合は、コーティングされたカバースリップの汚染されていない領域に同軸にしてみてください。カバースリップの外側の領域は特に粘着性があります。ステップ4.1.2で述べたように、生殖腺が無傷のままである限り、解剖操作によって胚の死体が壊れたかどうかは問題ではない。 - 針を使用して生殖腺の周りをスライスし、生殖腺を含む組織の一部が残りの死体から分離されるまで切ります。針で、この組織をコーティングされたカバースリップの新鮮な領域に引き込み、それが皿に付着するまで底に同軸にします。
注:最良のイメージングは、生殖腺自体がカバースリップに直接付着する場合に達成されます, オーバーリーティッシュを介して間接的に付着するのではなく、.したがって、組織が死体から遠ざかるように、生殖腺が無関係な組織ではなく、まずカバースリップに触れるように試みる。 - 接着組織を針で生殖腺からそっと引き離すことによって、できるだけ多くの周囲の組織を生殖腺から取り除く(図3D)。生殖腺に直接触れると生殖腺が損傷することは避けてください(図4E)。生殖腺が皿に十分に接着されるようにするには、生殖腺の周りを緩やかな円運動で針を動かし、移動する場合は、残りの付着組織に針を触れ、粘着性のカバースリップの新鮮な領域に生殖腺を向けます。生殖腺の検出可能な動きがなくなるまでこのプロセスを繰り返します。
- 胚の死骸に戻り、第2生殖巣を解剖する。このプロセスをできるだけ多くの胚で繰り返すが、25分を超えないようにしてください。組織生存率は、約40〜45分以上後にリンゲルの溶液中で損なわれます。
- まず、胚をファイリングしてその内部を露出させます(図3C)。胚をその中心からスライスし、針を後方に、生殖腺の間で移動させる。これは外部のキューティクルよりもはるかによく皿にくっつくので、いくつかの内部組織をからかいます。組織の粘着性は、生殖腺を明らかにし、それがカバースリップに付着することを可能にする次の操作を可能にする。
- 解剖が完了したら、消えないマーカーを使用してイメージング皿の外縁にレジストレーションマークを追加し、解剖中の向きを記録します。
- 接着剤でコーティングされたストリップを皿から取り出します。
- ストリップの下に一対の鉗子の底のプロングを静かに挿入し、ストリップを留めてゆっくりと上に傾けて、付着した生殖腺の乱れを最小限に抑えるために、リンガーの溶液のスロッシングをできるだけ少なくして皿から解放します。
注:ストリップは、解剖された生殖腺から離れて傾ける必要があります。
- ストリップの下に一対の鉗子の底のプロングを静かに挿入し、ストリップを留めてゆっくりと上に傾けて、付着した生殖腺の乱れを最小限に抑えるために、リンガーの溶液のスロッシングをできるだけ少なくして皿から解放します。
- リンゲル溶液のスロッシングを避けるように、皿をイメージング顕微鏡にそっと運びます。
5. イメージング
- ステージホルダー内に撮像皿を置き、レジストレーションマークを用いて、解剖時と同様におおよその向きで皿を配置する。明視野顕微鏡と低消費電力(約10倍)の対物レンズを使用して、カバースリップに付着している組織片を特定し、焦点を合わせます。接眼レンズの設定を切り替えて蛍光を明らかにし、両眼接眼レンズを使用して皿を体系的にスキャンし、イメージングソフトウェア内の各生殖腺の位置をマークします( 材料表を参照)。
注: 位置をマークする前に、生殖腺が視野の中央に配置されていることを確認してください。 - イメージング皿をホルダーに入れた状態でステージホルダーアセンブリ全体を慎重に取り外し、アセンブリをワークベンチに置きます。
- リンゲル溶液をインスリンを含む調製したイメージング媒体と交換する(ステップ1.2および3.1を参照)。
- P1000を使用して、イメージングディッシュの内側上部棚からすべてのリンゲル溶液を除去します(中央カバースリップ領域からリンゲル液をピペットで拭かないでください)。次に、P200に切り替えて、その先端を中央領域の残りのリンガーの表面のすぐ下に置きます。50~100 μLのリンゲルを慎重に除去する。ソリューション全体を削除しないでください。
- 約200μLのイメージングメディアを引き出し、残りのリンゲルの表面のすぐ下にP200チップを再び配置して、このイメージングメディアをゆっくりと追加します。次に、残りのイメージングメディア(約1,300μL)をディッシュに加え、上棚の最外縁から開始します。ピペッティング中は、流体の中央ドームに向かって移動し、最終的にピペットチップを両方にブラッシングして2つをマージします。皿に蓋をします。
メモ:イメージングメディアは、蒸発を防ぐために、ディッシュの内径全体を深さ約2mmで覆う必要があります(図4D)。
- 顕微鏡を高出力対物レンズ(63x、1.2 NA)に切り替え、使用する対物レンズ(対物レンズに必要な液浸流体の種類と屈折率)に基づいて適切な浸漬流体を適用し、ステージホルダーアセンブリを交換します。明視野顕微鏡を使用して、イメージング皿の底に付着した組織に焦点を合わせます。
注: ステージが移動されなかった場合、目標がフォーカスされると、最後の生殖腺が視界に入ります。 - マークされた各生殖腺の位置をステップ実行し、必要に応じてその位置を調整します。画像の明瞭さ、生殖腺の性別などに基づいて、画像化する生殖腺を選択します。イメージング設定(マルチチャンネル、露光時間、レーザー強度、Zシリーズ増分、適切な間隔でのタイムラプスなど)をカスタマイズします。イメージングを開始します。
注:雄性生殖腺は、ニッチと生殖腺の反対側の端、男性特異的体性生殖腺前駆体(msSGP)と呼ばれる小さくて円形の体細胞のクラスターの両方の存在によって識別することができる。 64-eGFP::moesin蛍光マーカーを使用する場合、ニッチ細胞は生殖腺内で2番目に明るい細胞であり、最も明るいのはmsSGPである。この段階では、女性の生殖腺はニッチもmsSGPも持っていません。
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Representative Results
「解剖準備の日」で説明したように画像化皿の調製を 図1に例示する。これらの方法は、最終的に、十分に水和した胚をカバースリップストリップに接着させ、これを皿の底に一時的に固定し、リンガーの溶液に沈める結果となるはずである(図1F)。ダイヤモンド先端のナイフを使用すると、22 x 22 mmのカバースリップを3~4本の小さなストリップにきれいにスライスできます(図1A)。これらのストリップを鉗子で処理しながら、ピペットを使用してこれらのストリップをコーティングするのに十分なヘプタン接着剤を転写し、接着剤でテクスチャー加工された表面を提供します(図1B)。コーティングされたストリップは、空のカバースリップボックスに簡単に保管でき、接着面を最大2時間清潔に保ちます(図1C)。これらのコーティングされたストリップが作られると、目標は、ストリップの長い縁の近くで、凝集体でストリップに胚を接着させることです(図1E)。最初に時計皿からきれいなスライドガラスにいくつかの胚を移し、それらを乾燥させる必要があります(図1D)。次に、鉗子をすばやく使用して、コーティングされたストリップを胚に優しく触れて、胚が接着するようにします(図1E)。次に、直ちにストリップを解剖皿の底に押し、胚を上に向けて、胚をリンゲルの溶液で覆います(図1F)。この目標が達成されれば、従来の明視野実体顕微鏡で胚を見ると、ビテリン膜内の完全に水和した健康な胚が明らかになります(図1G)。代わりに、これらの胚をストリップ上に移し、溶液で覆うプロセスに約30秒以上かかると、胚は脱水して弛緩する(図1G')。弛緩性胚は健康ではなく、解剖が非常に難しいため、このプロセス中に効率的に作業することが不可欠です。
図1:解剖前の胚の装着と水分補給 (A~F)胚を接着剤被覆カバースリップのストリップに接着させるステップは、ストリップを画像化皿に固定することを含む。(A)カバースリップをダイヤモンド先端のナイフ(矢じりで示すナイフ)で1回採点し、ストリップを作成します。(B)切断されたカバースリップストリップへのヘプタン接着剤の塗布、一対の鉗子で保持する。(C)カバースリップボックス内で乾燥させる4つの接着剤コーティングされたストリップ。(D–E)矢印は胚を指しています。(D)ヘプタンで採取され、顕微鏡スライドの端に排出された脱絨毛胚。余分なヘプタンをキムワイプで除去した。(E)胚が付着した接着剤コーティングストリップ。(F)解剖直前の皿の最終段取り。リンガーの解の浅い層(矢印)とストリップの内側の解剖円の上の配置(矢印)に注意してください。(G–G')胚は皿のストリップに付着した。(G)適切に水和された、濁った胚。(G')長期間の空気曝露のために脱水状態になった胚は、崩壊したビテリン膜によって明らかである。アスタリスクは弛緩性胚を示す。スケール バーは 0.5 mm です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
立体蛍光顕微鏡で胚を見ることで、GFPチャネルで自己蛍光を発する腸の明確な視覚化が可能になります。腸の形態学は、解剖する胚を選択する際に胚年齢の代理として役立つ。カバースリップのストリップに付着した胚は年齢によってわずかに異なるため、多様な腸内形態を提示する(図2A)。生殖巣ニッチ形態形成をライブ画像化するために、我々は初期段階16胚を解剖する。これらの胚は、偶数列に積み重ねられた4つの領域化された腸切片を提示する(図2B ́、点線)。若い胚は、嚢様の非領域化された腸内を呈し(図2C)、生殖腺の周囲に、無傷の器官の効率的な培養を可能にするのに十分な細胞外マトリックス(ECM)をまだ有していない。すでにニッチ圧縮を開始している古い胚は、均等に積み重ねられておらず、代わりに互いにシフトしている4つの腸領域を提示する(図2D'、点線)。これらの胚はより厚いキューティクルを有するため、解剖プロセスがより困難になる。
図2:生殖腺郭清のために適切に老化した胚を選択する。 解剖前に接着剤でコーティングされたカバースリップに接着した胚。胚は 64-eGFP::moesin(緑色)を発現し、生殖腺および脂肪体細胞をマークする。腸が緑色で自己蛍光を発することに注意してください。矢印は、各パネルに見える雄の生殖腺(明るく蛍光を発するmsSGPの存在によって識別される)を示す。スケールバーは0.25mmを示す(A)様々な段階の胚。(B–D)画像の中心にある異なる段階の胚は、左に前部を向き、背側を上に向ける。(b)解剖のために適切に老化された初期段階16胚。(B')4つの積み重ねられた腸領域は、点線の白い線で示されている。(C)解剖するには若すぎるステージ15の胚(下部胚)。生殖腺のちょうど前方の蛍光腸嚢にはまだ離散的な領域がないことに注意してください。(d)キューティクルの発生により解剖が困難な後期ステージ16の胚。4つの腸領域は、腸ループに備えて互いに回転し始めていることに注意してください。(D')4つの腸領域が概説されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
生殖腺に消えない蛍光マーカーを発現する胚を解剖することが重要であり、このマーカーは実体蛍光顕微鏡下で可視でなければならない。ここでは、 64-eGFP::moesin20を使用して 生殖腺(図2 と 図3、矢印)を解剖中の視覚化にマークすることを選択し ました。
生殖腺郭清プロセスを 図3に例示する。ポリリジンコーティングされた皿上の適切に段階的な胚の解剖は、これらの胚からの生殖腺のクリーンな単離を可能にする(図3D)。デビテルリン化された胚は、ディッシュに接着し、解剖前に便利な列に配置することができる(図3A)。胚の逸脱およびポリリジンへの移植は、組織が胚体の境界から押し出されるような不正確なプロセスである(胚1と胚2の間の組織片、および骨折した胚4; 図3A)。この不正確さは、生殖腺が無傷のままである限り、重要ではありません。標準的な立体蛍光顕微鏡は、デビテルリン化胚体内の生殖巣の同定を可能にする(図3B、 矢印)。鋭い解剖針による最初の数回の操作は、生殖腺を胚の死骸から分離するはずであるが、いくつかの自己蛍光組織は接着したままである(図3C)。追加の操作により、コーティングされた皿に直接付着する単離された生殖腺が得られます(図3D)。
図3:解剖プロセス (A–D)解剖プロトコルにおける逐次段階で64-eGFP::moesin(緑色)を発現する胚。(a)ディッシュのポリリジン被覆解剖領域に移植された4つのデビテリン化胚。胚が皿の中で連続した下向きの解剖を容易にするためにきちんとした列にどのように整列しているかに注目してください。胚1と胚2の間の組織の小片は、胚2からの腸の一部であり、手のデビテリン化中に押し出される。(B)(A)からの胚の高倍率図を、アスタリスクで示す。(C)正中線の下に切り身でできた胚の残りの死体。矢印は、まだ胚組織に深く埋め込まれた閉塞した生殖腺を示す。(D)完全に解剖された生殖腺。最小限の無関係な組織(矢印)だけが生殖腺の近くに残っていることに注意してください。矢印は雄の生殖腺を指しています。スケール バーは 0.25 mm です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
生殖腺が解剖されると、リンゲル溶液をイメージング培地に置き換え、解剖に使用したのと同じ皿で培養された生殖巣を直接画像化することができます。回転円盤共焦点顕微鏡を使用しています。共焦点顕微鏡で孤立した生殖腺を明視野で可視化すると、生殖腺の周囲を囲む暗い影(図4A~B、矢印)が明らかになり、これはイメージング中に生殖腺の完全性を維持するECMである。我々は、体細胞生殖腺細胞20においてGFP標識Fアクチンを発現する健康でよく培養された生殖巣の例と、すべての核28を可視化するためのRFP標識ヒストンマーカーを提示する(図4C–C')。この胚のすべての細胞はRFPヒストンマーカーを発現するので、生殖腺細胞と他の付着組織の細胞の両方が赤色発光を見る際に観察される。我々は、生殖腺特異的GFPマーカーを用いて生殖腺の境界を同定する(図4C ́、概要)。この培養生殖巣が健康であることは、生殖腺境界が滑らかで丸いため(図4 C ́、アウトライン)、生殖腺細胞が核全体に均一なレベルのRFPヒストン蛍光を有するため(図4C ́、矢印)。代わりに、生殖腺がイメージング中に十分に水和されていない場合、核および64-eGFP::moesin蛍光は、生殖腺組織が収縮するにつれて点状になり得る(図4D、矢印)。さらに、郭清中に生殖腺ECMが過度に損傷した場合、生殖腺境界が損なわれ、これは生殖腺の境界の外側に生殖腺特異的細胞(図4E、アスタリスク)が存在することによって明らかである(図4E、矢印)。
図4:ライブイメージング中の健康な生殖腺の位置を特定する。 (A)低倍率及び(B)カバースリップに付着した2つの解剖生殖巣の高倍率明視野図。(C–C')健康な生殖腺におけるニッチ圧縮の ex vivo イメージングからの1つのムービーフレーム。体細胞生殖腺細胞は 64-eGFP::moesin(緑)を発現し、すべての細胞は His2Av-mRFP(赤)を発現する。(C')白い点線でマークされた生殖腺境界。生殖腺境界の外側に見える His2Av−mRFPは、解剖された生殖腺にまだ付着している脂肪体である可能性が高い。矢印は、均一な His2Av−mRFPシグナルを有する生殖細胞核を指し、生殖腺が健康であることを示す。(D–E) エキソビボ 解剖プロトコールの代表的な否定的な転帰。(D) 媒体蒸発のために生殖腺が脱水した撮像セッションからのフレーム。 His2Av-mRFPが凝縮するにつれてピクノティック核(矢印)と、生殖腺境界に沿って 64-eGFP::moesinの不連続な斑点に注意してください。(e)解剖中に細胞外マトリックスが侵害された エクスビボ イメージングフレーム。一部の生殖細胞(アスタリスク)が生殖腺境界(矢印)を出ていることに留意されたい。生殖細胞は nos-lifeact::tdtomato(マゼンタ)で標識され、体細胞生殖腺細胞は 64-eGFP::moesin(緑色)で標識されています。スケールバーは20μmを示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この エクスビボ イメージング法を用いて生殖巣を約5時間培養することができ、生殖腺発生後期に起こる動的形態形成事象の画像取得を可能にする。私たちの研究室では、このプロトコルを使用して、形成幹細胞ニッチ17 の圧密化を画像化することに成功しました(図5)。圧密化の前に、ニッチは生殖腺前部の体細胞の緩い凝集体であり(図5A、 緑色)、 nos-lifeact::tdtomato29 ( 材料表を参照)で標識された生殖細胞に囲まれ、その第1層は生殖細胞系幹細胞(図5A、 マゼンタ)である。このニッチ集合体は、最初は不規則な境界を提示する(図5A '、点線)。イメージングの過程で、個々のニッチ細胞が位置を再配置し、ニッチ凝集体がより滑らかな境界を獲得するのを観察します。これらの細胞再配列はまた、ニッチ領域の減少をもたらす(図5C)。この発達段階と同時に起こる細胞の再配列と隣接する生殖細胞分裂の観察は、ニッチ圧縮の根底にあるメカニズムの理解に役立った17。したがって、このプロトコルは、後期段階の生殖腺における形態形成事象を分析するために必要な分解能で、細胞の再配列、形状変化、分裂、および他の細胞事象を視覚化する能力を提供する。
図5:ニッチ圧縮を受けている エクスビボ 培養生殖巣。初期のステージ16胚からの生殖腺の解剖後すぐに獲得したイメージングシリーズからの静止画。(A-C)生殖細胞(マゼンタ)は nos-lifeact::tdtomatによって標識され、体細胞生殖腺細胞(緑色)は six4-eGFP::moesinによって標識される。ニッチ(点線の白い線)は A'-C'で輪郭を描いています。スケールバーは10μmを示す。前は左に、後は右です。(a)イメージングシリーズの最初の時点(t=0分)で、ニッチ細胞は生殖腺前部での集合を終え、圧迫の初期段階にある。(B)イメージングシリーズと圧縮プロセス(t = 1時間48分)の途中で、ニッチは円形になり始めましたが、そのエッジは不規則なままです。(c)撮像シリーズの終わり近く(t=4時間21分)に、ニッチは高度に平滑化された円形の境界を有する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
性腺形成の間、胚性生殖巣、特に雄性生殖巣15内の幹細胞ニッチは、急速な形態学的変化を受ける。これらのダイナミックな変化の根底にある発達メカニズムは、ライブイメージング技術によって最もよく理解されます。しかしながら、胚期ステージ17では、大規模な筋肉収縮17の発症により生殖巣の生体内イメージングが不可能になる。このプロトコルにより、我々は成功した代替手段を提供する:ex vivoライブイメージングのためのイメージング皿上に生殖腺を直接解剖する。このプロトコルは、後期段階の胚性生殖腺のライブイメージングを達成するために利用可能な唯一の方法を提示する。
プロトコルの重要なステップは、器用さとタイミングに重点を置いて実行する必要があります。解剖の前に、胚の迅速な装着は、胚が脱水せず、健康で乱雑な状態を維持し、分解および解剖を容易にするために最も重要である。解剖中は、繊細で正確な操作のみを使用して達成される生殖腺細胞外マトリックスの破壊を避けることが不可欠です。このような器用さの使用はまた、生殖腺が画像化皿に直接接触することを確実にし、それによってカバースリップを介して直接鮮明な画像化を可能にする。解剖後、生殖腺の脱落を防ぐために、ピペットによる穏やかな吸引と排出のみを使用して、リンガーの溶液をイメージングメディアに切り替える必要があります。最後に、全体的な解剖時間を25分に制限することが重要です。これにより、解剖中にリンゲル溶液に費やされる時間、およびコンフォカルでの組織の位置が、非毒性曝露に限定されることが保証される。練習が増えると、解剖速度が向上し、解剖シーケンスのパーソナライゼーションが行われます。私たちの経験では、約1週間の定期的な練習の後に十分な解剖が達成され、解剖の完全な習得は約1ヶ月で達成できます。学習を容易にするために、プロトコル全体を実行する前に個々のステップを練習することをお勧めします。
解剖に使用される胚の遺伝子型から始めて、このプロトコルに関連する課題を改善する多くのベストプラクティスがあります。生殖腺をマークするために使用される導入遺伝子の複数のコピーを組み込むと、生殖腺がより明るくなり、したがって視覚化および解剖が容易になる。解剖自体は鋭い針で最もよく機能しますが、イメージング皿の底に曲がり、無関係な組織に負担がかかるため、過度に鋭くしないでください。シュナイダーのイメージングメディアは緑色の発光スペクトルで自己蛍光を発するため、メディアが加えられるとGFPでマークされた生殖腺を見つけるのが難しくなります。したがって、共焦点イメージングソフトウェアを使用して、生殖腺がまだリンガーの溶液中にある間に生殖腺の位置をマークすることが重要です。共焦点で生殖腺を見つけるのが難しい場合は、次の解剖の後、解剖顕微鏡で静止している間に皿内の生殖腺の相対位置をスケッチまたは画像を撮ることをお勧めします。そして、解剖時のその向きを示すように皿の外側に印を付け、共焦点顕微鏡に移行するときにこの向きを一致させる。コンフォカルに位置すると、生殖腺が破壊または骨折しているように見える場合は、次の解剖で生殖腺を囲むより付着した組織を残してみてください。それどころか、生殖腺が存在するが、すべての平面にわたってぼやけているように見える場合、カバースリップと生殖腺の間に組織が存在する可能性が高く、将来の解剖は、付着組織からの生殖腺のより良い分離のために努力すべきである。私たちの経験では、これらのプラクティスを採用することで、このプロトコルの学習と実行が容易になりました。
このプロトコルの形成中に、適用可能ないくつかの変更を特定しました。ニッチ圧縮研究のために、我々はステージ16で胚を解剖することを目指しています。この段階では、胚はまだかなりの量のキューティクルを発達させておらず、ポリリジンコーティングされた皿に容易に付着する。しかしながら、この技術は、第1の切開のためにポリリジンコーティング領域の内壁にそれらを貼り付けることによって、キューティクルで古い胚を解剖するように改変され得る。内部組織が露出すると、胚の死体はポリリジンに固執し、解剖は通常どおり進むことができる。胚年齢の調整に加えて、我々はこの技術を調整して、同じ皿で複数の遺伝子型を解剖することに成功しました。例えば、ホモ接合型変異体は、バランサー染色体上の 変形−YFPなどの容易に識別可能なマーカーの使用によって、兄弟ヘテロ接合体から分離することができる。デビテルリン化後、胚はマーカーの有無に基づいてカバースリップの両側に移されるべきである。解剖は、プロトコルに記載されているように皿の中で下方に進行し、異なる遺伝子型の分離を維持するために特別な注意を払わなければならない。また、このプロトコルは、シュナイダー以外の培養培地を使用するように変更される可能性がありますが、ShieldsとSang M3 Insect Mediaの表面的な調査では、生存不能な生殖腺が得られました(データは示されていません)。さらに、このプロトコルは、薬物を画像媒体と組み合わせるだけで薬理学的操作とよく調和します。5時間のイメージング期間にわたって、有効な濃度を維持するために薬物の再添加が必要な場合があります。最後に、このプロトコルは、男性の生殖腺に特有の現象であるニッチ圧縮を視覚化することを目的として開発されましたが、理論的には、このプロトコルは、ニッチとmsSGPsを欠いている生殖腺を単に解剖してイメージングするだけで、発達中の卵巣をライブイメージングするために実装することもできます。
この技術に関連する制限は、培養時間の長さ、および培養のエクスビボ性に関する。中期段階のショウジョウバエ卵室30の場合と同様に、培養生殖巣は、約5時間のエクスビボライブイメージング後に死に始め、組織の完全性の喪失(核がピクトーシスおよび細胞膜が収縮する)によって証明される。したがって、雄性生殖腺の後期段階の事象を探索したい場合は、ここで提示されたプロトコルを変更して第1齢以上の幼虫の生殖腺を解剖し、ここで提示したものと同様の条件下でそれらを画像化する必要があります。しかし、培養条件の改善が図られた場合、5時間過ぎにex vivoライブイメージングが行われる可能性を排除するものではないが、生殖巣の発達に胚内からの機械的手がかりが必要な場合は限界があるかもしれない。おそらく、この技術の最も深刻な欠点は、その固有のエクスビボの性質によるものです。エクスビボで培養すると、細胞は、インビボ生物学31を代表しない不自然な可能性を有し得る。さらに、培地含量およびマトリックス剛性を含む培養環境の微妙さは、細胞挙動に劇的な影響を及ぼし得る32。この感度を念頭に置いて、培養条件が生体内生物学を正確に反映していることを確認することが重要です。我々は、インビボニッチ発生およびシグナル伝達がエクスビボで反復されることを証明するための措置をとった17。簡単に言えば、我々は、マーカーファシクリン-IIIおよびE-カドヘリンを用いて、ニッチ細胞の運命が維持され、ニッチ細胞の数が変化していないことを確認した。また、STATシグナルが存在し、生殖細胞系幹細胞が直交して分裂し、ニッチな機能が維持されていることが示唆される。しかし、関連する生体内生物学が生殖腺内の他の非ニッチ組織において無傷のままであることは検証されていない。これらの他の組織の将来のエクスビボ調査には、これが実際に当てはまることを確認するための包括的な分析を含める必要があります。
このプロトコルでとり得る将来の方向性は、1つの解剖セッションが対照群と薬物治療群の両方を含むことができるように、画像化皿内に障壁を組み込むことを含むであろう。この強化により、技術的反復間の誤差が最小限に抑えられ、科学的厳密さが向上します。
このプロトコルに代わる真の選択肢は他になく、胚発生後期にこの器官のライブイベントを調べるために利用可能な唯一の方法であるためです。そのため、生殖腺の形態形成に関する以前は答えられなかった疑問が、この進歩とともにアクセス可能になりました。これらの質問には、細胞分裂の複雑さ、細胞骨格の変化、および幹細胞ニッチ形成および性腺形成を支配する細胞インターカレーション事象が含まれる。これらの事象のいずれも、修正および染色技術を用いて取得されたこれらのプロセスの静止画では検出できない。全体として、この方法は後期胚 性ショウジョウバエ 生殖腺のダイナミクスを調査する可能性を解き放ち、そのようなブレークスルーは、幹細胞ニッチ生物学、piRNA生物学、および器官形成を含む無数の生物学的分野の進歩に強い意味を持つ。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
我々は、この議定書の早期開発に多大な貢献をしたLindsey W. PlasschaertとJustin Suiに感謝したい。著者らは、試薬に対する寛大さ、特にルース・レーマンとベンジャミン・リンが、出版前に Nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'ラインを贈呈したことに感謝しています。ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(NIH P40OD018537)から得られたストックを本研究に使用した。この作業は、NIH RO1 GM060804、R33AG04791503、R35GM136270(S.D.)、およびトレーニング助成金T32GM007229(B.W.)およびF32GM125123(L.A.)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
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