Summary
Questo protocollo fornisce un metodo efficiente di digestione della collagenasi per l'isolamento di adipociti vitali e cellule di frazione vascolare stromale-SVF dal grasso viscerale umano in un unico processo, compresa la metodologia per ottenere RNA di alta qualità dagli adipociti e la fenotipizzazione dei macrofagi SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per l'analisi mediante citometria a flusso.
Abstract
Il tessuto adiposo viscerale (VAT) è un organo metabolico attivo composto principalmente da adipociti maturi e cellule della frazione vascolare stromale (SVF), che rilasciano diverse molecole bioattive che controllano i processi metabolici, ormonali e immunitari; Attualmente, non è chiaro come questi processi siano regolati all'interno del tessuto adiposo. Pertanto, lo sviluppo di metodi che valutino il contributo di ciascuna popolazione cellulare alla fisiopatologia del tessuto adiposo è cruciale. Questo protocollo descrive le fasi di isolamento e fornisce le linee guida necessarie per la risoluzione dei problemi per un isolamento efficiente di adipociti maturi vitali e SVF da biopsie umane di VAT in un unico processo, utilizzando una tecnica di digestione enzimatica della collagenasi. Inoltre, il protocollo è anche ottimizzato per identificare sottogruppi di macrofagi ed eseguire l'isolamento dell'RNA degli adipociti maturi per studi di espressione genica, che consente di eseguire studi che sezionano l'interazione tra queste popolazioni cellulari. In breve, le biopsie VAT vengono lavate, tritate meccanicamente e digerite per generare una sospensione unicellulare. Dopo la centrifugazione, gli adipociti maturi vengono isolati mediante flottazione dal pellet SVF. Il protocollo di estrazione dell'RNA garantisce un'elevata resa di RNA totale (compresi i miRNA) dagli adipociti per i saggi di espressione a valle. Allo stesso tempo, le cellule SVF vengono utilizzate per caratterizzare sottogruppi di macrofagi (fenotipo pro- e anti-infiammatorio) attraverso l'analisi della citometria a flusso.
Introduction
Il tessuto adiposo bianco è composto non solo da cellule adipose o adipociti, ma anche da una frazione di cellule non adipose nota come frazione vascolare stromale (SVF), che contiene una popolazione cellulare eterogenea costituita da macrofagi, altre cellule immunitarie come cellule T regolatorie (Treg) ed eosinofili, preadipociti e fibroblasti, circondati da tessuto vascolare e connettivo 1,2. Il tessuto adiposo (AT) è oggi considerato un organo che regola i processi fisiologici legati al metabolismo e all'infiammazione attraverso adipochine, citochine e microRNA prodotti e rilasciati da diverse cellule nel tessuto, con effetti autocrini, paracrini ed endocrini 3,4. Nell'uomo, il tessuto adiposo bianco comprende il tessuto adiposo sottocutaneo (SAT) e il tessuto adiposo viscerale (VAT), con importanti differenze anatomiche, molecolari, cellulari e fisiologiche tra loro 2,5. Il SAT rappresenta fino all'80% dell'AT umano, mentre il VAT si trova all'interno della cavità addominale, principalmente nel mesentere e nell'omento, essendo metabolicamente più attivo6. Inoltre, il VAT è un organo endocrino che secerne mediatori con un impatto sostanziale sul peso corporeo, sulla sensibilità all'insulina, sul metabolismo lipidico e sull'infiammazione. Di conseguenza, l'accumulo di IVA porta all'obesità addominale e alle malattie correlate all'obesità come il diabete di tipo 2, la sindrome metabolica, l'ipertensione e il rischio di malattie cardiovascolari, rappresentando un migliore predittore della mortalità associata all'obesità 6,7,8,9.
In condizioni omeostatiche, gli adipociti, i macrofagi e le altre cellule immunitarie cooperano per mantenere il metabolismo dell'IVA attraverso la secrezione di mediatori antinfiammatori10. Tuttavia, l'eccessiva espansione dell'IVA promuove il reclutamento di cellule T attivate, cellule NK e macrofagi. Infatti, nel VAT magra, il rapporto dei macrofagi è del 5%, mentre questo rapporto sale fino al 50% nell'obesità, con polarizzazione dei macrofagi dal fenotipo antinfiammatorio a quello pro-infiammatorio, generando un ambiente infiammatorio cronico10,11.
Come conseguenza della pandemia di obesità, è sorto un numero sorprendente di rapporti che affrontano diversi argomenti di ricerca IVA, tra cui la biologia degli adipociti, l'epigenetica, l'infiammazione, le proprietà endocrine e le aree emergenti come le vescicole extracellulari, tra gli altri 8,10,12,13. Tuttavia, sebbene l'ambiente VAT sia definito dal crosstalk tra gli adipociti e i macrofagi residenti o in arrivo, la maggior parte degli studi si è concentrata su una sola popolazione cellulare e ci sono scarse informazioni sull'interazione di queste cellule in VAT e sulle loro conseguenze fisiopatologiche11,14. Inoltre, sono stati condotti preziosi studi sull'interazione adipocita-macrofagi nell'AT utilizzando linee cellulari, prive delle condizioni di priming in vivo 11,14,15. Una strategia adeguata per sezionare l'interazione o il particolare contributo di queste cellule in VAT richiede l'isolamento di entrambi i tipi di cellule dalla stessa biopsia adiposa per eseguire saggi in vitro che rispecchino il più possibile le proprietà in vivo che regolano il metabolismo del VAT.
Sebbene i metodi di dissociazione non enzimatica basati su forze meccaniche per rompere l'AT garantiscano una manipolazione minima, questi metodi non possono essere utilizzati se l'obiettivo è quello di studiare le cellule SVF, poiché hanno una minore efficienza nel recupero cellulare e una bassa vitalità cellulare rispetto ai metodi enzimatici, ed è necessario un volume maggiore di tessuto16,17. La digestione enzimatica con collagenasi è un metodo delicato che consente un'adeguata digestione del collagene e delle proteine della matrice extracellulare dei tessuti fibrosi come il WAT18 ed è spesso utilizzato quando la tripsina è inefficace o dannosa19. Il protocollo fornisce linee guida fondamentali per la risoluzione dei problemi per l'isolamento efficiente di adipociti maturi vitali e cellule SVF da biopsie umane VAT in un unico processo, utilizzando una tecnica di digestione enzimatica della collagenasi, fornendo informazioni per garantire rese elevate (quantità, purezza e integrità) di RNA totale da adipociti maturi, compresi i microRNA, per applicazioni di espressione a valle. Allo stesso tempo, il protocollo è ottimizzato per identificare sottogruppi di macrofagi da cellule SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per ulteriori analisi mediante citometria a flusso20.
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Protocol
Questo protocollo è stato approvato dall'IRB dell'Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). La partecipazione era volontaria e tutte le donne iscritte hanno firmato il modulo di consenso informato.
1. Prelievo di tessuto adiposo viscerale
- Ottenere biopsie IVA attraverso omentectomia parziale durante il taglio cesareo da donne adulte sane con gravidanze singole a termine senza travaglio.
- Dopo la chiusura uterina e l'emostasi, procedere all'individuazione di un maggiore omento ed estenderlo su un impacco bagnato. L'AT esposto è l'IVA.
- Individua il vaso sanguigno più grande e traccia una linea immaginaria di 7 x 5 cm fino alla base dell'omento maggiore.
- Identifica una zona avascolare e usa la pinza Kelly per forare il lato esterno della VAT.
- Utilizzare la pinza di Ochsner per bloccare il lato prossimale e distale nella zona in cui è stata praticata la VAT e utilizzare le forbici Metzenbaum per tagliare il tessuto.
- Lega l'omento maggiore con il numero 1 di seta nera.
- Rimuovere la pinza di Ochsner e valutare l'emostasi.
- Mettere la biopsia VAT in un contenitore sterile e trasportarla immediatamente in laboratorio.
2. Digestione enzimatica del tessuto adiposo viscerale e isolamento degli adipociti maturi e delle cellule della frazione vascolare stromale
- Pesare la biopsia IVA e risciacquare con 1x PBS pH 7,4.
- Tagliare 4 g di VAT e utilizzare le forbici per tritare il tessuto in piccoli pezzi in un vassoio di dissezione.
- Trasferire l'IVA tritata in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml, aggiungere 20 ml di PBS e agitare delicatamente per rimuovere l'eccesso di globuli rossi.
- Scartare PBS e ripetere la procedura due volte.
- Trasferire l'IVA in una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 mL e aggiungere 25 mL di soluzione digestiva (0,25% collagenasi di tipo II, 5 mM di glucosio, 1,5% albumina in PBS).
- Incubare a 37 °C per 60 minuti in agitatore orbitale a 125 giri/min.
- Filtrare il tessuto digerito attraverso tre strati di garza in una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 ml.
- Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Si ottengono due fasi, una fase superiore che corrisponde agli adipociti maturi, mentre le cellule SFV rimangono nel pellet. Trasferire delicatamente gli adipociti maturi in una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 ml utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Aggiungere 20 mL di PBS freddo, agitare delicatamente e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Scartare PBS e ripetere la procedura due volte.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire delicatamente gli adipociti maturi in una provetta per microcentrifuga priva di DNasi-RNasi da 1,5 mL.
- Centrifugare a 200 x g per 1 minuto a 4 °C e rimuovere il PBS in eccesso utilizzando una micropipetta P200. Ripetere questo passaggio se necessario.
- Trasferire delicatamente 300 μL di sospensione adipocitaria matura in provette per microcentrifuga da 1,5 mL prive di DNasi-RNasi. Conservare gli adipociti maturi a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
NOTA: Gli adipociti non formano un pellet. - Una volta separati gli adipociti (passaggio 2.9), aspirare la maggior parte della soluzione di digestione con una pipetta di trasferimento, mantenendo il pellet SVF sul fondo della provetta.
- Trasferire il pellet con le cellule SVF in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Lavare delicatamente il pellet cellulare, risospendendo in 20 mL di PBS freddo 1x pipettando su e giù.
- Centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare rapidamente il surnatante per decantazione.
- Eseguire un secondo lavaggio ripetendo i passaggi 2.17 e 2.18.
- Aggiungere 5 mL di tampone di lisi dei globuli rossi bilanciato a temperatura ambiente (RT) al pellet SVF e sospendere mediante pipettaggio ripetuto. Non vorticare.
- Incubare per 5 minuti a RT e centrifugare per 5 minuti a 800 x g. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento e smaltirlo correttamente.
- Per neutralizzare il tampone di lisi, aggiungere 10 mL di PBS 1x freddo e mescolare delicatamente fino a quando il pellet cellulare non si disaggrega.
- Centrifugare a 800 x g per 5 min per ottenere il pellet SVF ed eliminare il PBS. Un pellet bianco dovrebbe essere visibile sul fondo del tubo.
- Risospendere le cellule in 5 mL di PBS 1x a RT mediante pipettaggio ripetuto e filtrate attraverso tre strati di garza in una nuova provetta conica da 50 mL. Successivamente, queste cellule saranno utilizzate per la caratterizzazione delle sottopopolazioni di macrofagi mediante citometria a flusso.
3. Estrazione di RNA da adipociti maturi
- Preparare un'area pulita, utilizzando uno spray decontaminante a RNasi per evitare la degradazione dell'RNA. Utilizzare un set di pipette riservato alle procedure a RNA. Tutti i tubi e i puntali utilizzati devono essere privi di RNasi.
- Scongelare la sospensione adipocitaria matura (paragrafo 2.14) a 4 °C se è stata conservata a -80 °C.
NOTA: Evitare più cicli di gelo-scongelamento. - Lisare le cellule aggiungendo 1.000 μL di reagente a base di acido-guanidinio-fenolo e miscelare accuratamente con una micropipetta P1000 per omogeneizzare.
- Incubare per 5 minuti a RT per aumentare la dissociazione dei complessi nucleoproteici.
- Centrifugare il lisato cellulare per 5 minuti a 12.000 x g a RT. Si otterranno tre fasi: una fase superiore (gialla) corrispondente ai lipidi adipocitari, una fase intermedia (rosa) corrispondente agli acidi nucleici e una fase a pellet (detriti cellulari).
- Rimuovere con cautela lo strato lipidico, utilizzando una micropipetta P200.
- Trasferire la fase intermedia in una nuova provetta da 2 mL, evitando che i residui lipidici e i pellet disturbino (circa 700 μL).
4. Purificazione dell'RNA totale, compresi i microRNA
NOTA: Per ottenere RNA totale di alta qualità viene utilizzato un metodo di purificazione dell'RNA totale basato su colonna.
- Aggiungere un volume uguale di etanolo (95%-100%) al campione della sezione 3.7, circa 700 μL, e mescolare a mano capovolgendo la provetta per 10 s.
- Trasferire 700 μL di miscela in una colonna inserita in una provetta di raccolta, centrifugare ed eliminare il flusso continuo.
- Ricaricare la colonna e ripetere il passaggio 4.2.
- Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta.
- Aggiungere 400 μL di tampone di prelavaggio alla colonna e alla centrifuga. Scartare il flusso continuo e ripetere questo passaggio.
- Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare per 2 minuti.
- Trasferire con cautela la colonna in un tubo privo di nucleasi.
- Aggiungere 50 μL di acqua priva di nucleasi direttamente alla matrice della colonna ed eluire l'RNA mediante centrifugazione. Preparare aliquote da 10 μL utilizzando provette da microfuge da 200 μL.
- Mettere immediatamente le aliquote sul ghiaccio e utilizzarne una per determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA.
- Preparare un'aliquota di 5 μL di RNA totale aggiustata a 100 ng/μL per misurare l'integrità dell'RNA e la concentrazione di microRNA.
- Conservare a -80 °C fino al momento dell'utilizzo.
5. Determinazione della concentrazione, della purezza e dell'integrità dell'RNA adipocitario maturo; saggio di quantificazione dei microRNA
NOTA: Le determinazioni della concentrazione e della purezza dell'RNA vengono eseguite utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis; L'integrità dell'RNA e la quantificazione dei miRNA vengono eseguite utilizzando un analizzatore di controllo della qualità dell'RNA.
- Lavare il lettore di campioni con acqua di grado molecolare e strofinare.
- Caricare 2 μL di acqua di eluizione (vuoto), modificare l'impostazione in RNA e fare clic sul pulsante Vuoto .
- Caricare 2 μL di campione e fare clic sul pulsante Misura .
- Al termine della lettura, registrare i rapporti A260/A280 e A260/A230 e la quantità di RNA (ng/μL) (Figura 1A).
NOTA: L'RNA con rapporto OD260/OD280 e OD260/OD230 intorno a 2,0 è considerato puro. - Misurare il numero di integrità dell'RNA (RIN) utilizzando un kit di integrità dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore (Figura 1B).
NOTA: Un RIN =10 corrisponde a un RNA intatto, mentre un RIN ≤ 3.0 indica un RNA fortemente degradato. Per i microarray di espressione o RT-qPCR, utilizzare l'RNA con RIN ≥ 6.0. - Utilizzare un piccolo kit di RNA per determinare la concentrazione e la percentuale di microRNA, seguendo le istruzioni del produttore (Figura 1C).
NOTA: Per evitare la sovrastima di piccoli e micro RNA, utilizzare campioni di RNA con RIN ≥ 6.0.
6. Conta e vitalità delle cellule della frazione vascolare stromale
- Diluire 10 μL di sospensione cellulare SVF (sezione 2.24) in 90 μL di soluzione di blu di tripano allo 0,4% (diluizione finale 1:10) e applicare 10 μL a un emocitometro standard.
- Contare attentamente le cellule vitali, escluse le cellule morte, in quattro quadrati all'angolo della camera di conteggio.
- Determinare la concentrazione cellulare presente nella sospensione originale: Concentrazione cellulare = Conta cellulare totale/4 x fattore di diluizione (10) x 10.000 = Cellule/mL
- Per calcolare la resa cellulare (cellule per grammo di tessuto) ottenuta, moltiplicare la concentrazione cellulare per il volume totale del campione originale (in ml) e dividere per il peso del tessuto digerito (in grammi).
- Valutare la vitalità cellulare come percentuale di cellule viventi come segue: % Vitalità = (Numero di cellule vitali / Numero totale di cellule) x 100.
7. Caratterizzazione di sottogruppi di macrofagi da frazione vascolare stromale
- Trasferire un totale di 1 x 106 cellule SVF/mL in una provetta in polipropilene a fondo tondo da 5 mL per citometria a flusso e cellule a pellet mediante centrifugazione a 800 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Vorticare con cautela per allentare il pellet e risospendere le celle in 100 μL di PBS 1x a RT.
- Aggiungere la concentrazione ottimale pretitolata di ciascun anticorpo monoclonale coniugato con fluorocromo specifico per un antigene di superficie cellulare; mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti al buio a RT.
- Aggiungere un eccesso di PBS freddo (≈ 1 mL) e centrifugare l'SVF a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Scartare rapidamente i surnatanti per decantazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet.
- Aggiungere 500 μL di soluzione lisante 1x e incubare per 15 minuti a RT, proteggendo i tubi dalla luce diretta.
- Rimuovere la soluzione dopo la centrifuga a 400 x g per 5 minuti a 4 °C e conservare a 2-8 °C al buio fino all'acquisizione dei dati.
- Vorticare accuratamente le cellule a bassa velocità per ridurre l'aggregazione prima di acquisire.
- Risospendere il pellet SVF in 5 mL di fluido della guaina a RT e successivamente filtrare attraverso tre strati di garza in una nuova provetta in polipropilene a fondo tondo da 5 mL prima dell'analisi mediante citometria a flusso, per ridurre l'intasamento delle linee di selezione delle cellule.
- Vorticare brevemente ogni tubo prima dell'analisi.
- Acquisire i dati dai campioni di interesse. Per l'analisi del flusso, contare un minimo di 10.000 eventi.
NOTA: Se si utilizza un citometro a flusso per la selezione cellulare, separare i macrofagi per l'applicazione in studi successivi.
8. Strategia di gating
- Tracciare l'altezza o la larghezza rispetto all'area per la dispersione diretta (FSC) per determinare la popolazione di singoletto (Figura 2A).
- Selezionare le cellule tracciando l'area per la dispersione laterale (SSC) rispetto a FSC, scartando i detriti cellulari (Figura 2B).
- Dalle cellule selezionate, identificare le popolazioni che esprimono CD45 come cellule ematopoietiche (Figura 2C) e le cellule CD45/CD14 doppie positive come macrofagi (Figura 2D).
- Dai macrofagi CD45+/CD14+, rilevare le cellule HLA-DR negative e positive (Figura 2E).
NOTA: Includere i controlli di compensazione per il pannello anticorpale e regolare la sovrapposizione spettrale su un citometro a flusso multicolore adeguato per il pannello. Eseguiamo analisi di citometria a flusso utilizzando un citometro dotato di tre laser (laser viola da 405 nm, laser blu da 488 nm e laser rosso da 640 nm) e rivelatori per i fluorocromi indicati.
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Representative Results
Questo protocollo descrive un metodo enzimatico che utilizza la digestione della collagenasi seguita da centrifugazione differenziale per isolare, in un unico processo, adipociti maturi vitali e cellule SVF da biopsie VAT ottenute da donne in gravidanza sane dopo omentectomia parziale. In questo caso, utilizziamo gli adipociti per l'estrazione dell'RNA e la SVF per la fenotipizzazione dei macrofagi.
Il protocollo di estrazione dell'RNA ha permesso di ottenere RNA con un'elevata integrità, e RNA con un'elevata purezza e microRNA da adipociti maturi (Figura 1). L'integrità dell'RNA valutata da un analizzatore di controllo qualità dell'RNA ha portato a valori eccellenti per i campioni di adipociti isolati con il protocollo (RIN = 9,7).
Il totale delle cellule nucleate presenti in VAT-SVF era di circa 2,8 x 106 cellule/grammo di IVA (2,8 x 106 ± 1,7 x 106), con una vitalità del 64% (63,9 ± 2,0) utilizzando il test di esclusione del blu di tripano. Le cellule SVF sono state marcate con anticorpi primari coniugati con fluorofori per identificare e caratterizzare i macrofagi AT mediante analisi di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. L'analisi della citometria a flusso genera grafici che mostrano diverse popolazioni cellulari in base ai marcatori cellulari (Figura 2). Inizialmente, tracciando l'area di dispersione in avanti (FSC-A) rispetto all'altezza di dispersione in avanti (FSC-H), gli aggregati di cellule sono stati facilmente eliminati dall'analisi (Figura 2A). Quindi, i detriti cellulari sono stati esclusi controllando le cellule in base alle dimensioni e alla complessità corrette utilizzando l'area di dispersione diretta (FSC-A) e l'area di dispersione laterale (SSC-A) (Figura 2B). Successivamente, per analizzare i macrofagi, non è stato necessario escludere altre cellule immunitarie. In primo luogo, le cellule di lignaggio monocitario/macrofago sono state selezionate mediante l'uso di marcatori CD45 e CD14 (Figura 2C,D). Successivamente, le cellule doppie positive CD45/CD14 sono state separate in base all'espressione del marcatore macrofagico HLA-DR, dove sono stati identificati due sottogruppi di macrofagi: HLA-DR- e HLA-DR+ (Figura 2E).
Figura 1: Controllo di qualità dell'RNA da adipociti maturi. (A) concentrazione di RNA, rapporto 260/280 e 260/230; (B) Analisi dell'integrità. L'elettroferogramma, l'immagine su gel e il numero di integrità dell'RNA sono stati ottenuti utilizzando un analizzatore di controllo della qualità dell'RNA e un kit di analisi dell'RNA; (C) quantificazione dei microRNA. L'elettroferogramma, l'immagine del gel e la percentuale di microRNA sono stati ottenuti utilizzando un analizzatore di controllo della qualità dell'RNA e un piccolo kit di RNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione dei macrofagi dal tessuto adiposo viscerale. Grafici rappresentativi di citometria a flusso di macrofagi della frazione vascolare stromale isolati da tessuto adiposo viscerale raccolto durante un taglio cesareo utilizzando la digestione della collagenasi. (A) Identificazione di singoletti utilizzando un primo gate FSC-A (Forward Scatter-area) vs FSC-height (FSC-H) per rimuovere i doppietti. (B) Per eliminare i detriti è stato utilizzato un secondo gate Forward Scatter-area (FSC-A) vs Side Scatter-area (SSC-A) per eliminare i detriti in base alle dimensioni e alla densità. (C,D) SSC-A vs CD45 gate ha identificato le cellule di origine ematopoietica e SSC-A vs CD14 gate ha identificato i macrofagi. (E) I macrofagi CD45+/CD14+ totali sono stati controllati in base al marcatore HLA-DR e sono stati identificati due sottogruppi di macrofagi: HLA-DR- e HLA-DR+. I grafici illustrano i dati rappresentativi dei singoli soggetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'IVA svolge un ruolo cruciale nella regolazione metabolica e nell'infiammazione. Il crescente interesse per il ruolo degli adipociti e delle cellule immunitarie nell'infiammazione cronica associata all'obesità ha portato allo sviluppo di diverse tecniche per separare la SVF e le cellule adipose presenti nell'AT. Tuttavia, la maggior parte delle tecniche non consente di ottenere questi due diversi set di cellule utilizzabili per applicazioni a valle dalla stessa biopsia VAT in un'unica procedura, il che potrebbe essere cruciale per gli studi sulle interazioni tra adipociti e cellule SVF. Pertanto, abbiamo implementato questo protocollo che fornisce una descrizione dettagliata per isolare gli adipociti maturi vitali e le cellule SVF presenti in una biopsia VAT. Differisce dai precedenti rapporti nel tempo di digestione tissutale e nella concentrazione di collagenasi, nonché nel tempo e nella velocità di centrifugazione per la separazione cellulare, consentendo un'adeguata resa di RNA adipocitario e una caratterizzazione dettagliata del sottogruppo dei macrofagi.
Sono state proposte numerose tecniche di isolamento enzimatico e non enzimatico per cellule derivate da AT, con diversi effetti sulle caratteristiche biologiche e sulle proprietà funzionali delle cellule isolate 17,21,22,23,24, per cui è necessario scegliere la strategia più appropriata in base all'obiettivo perseguito. Frequentemente, l'isolamento di adipociti maturi e SVF dal tessuto adiposo si ottiene utilizzando gli enzimidi dissociazione tissutale 25,26,27. Sebbene diversi enzimi possano essere utilizzati per dissociare l'AT, la digestione enzimatica con collagenasi rimane il gold standard per digerire questo tessuto27,28. Poiché l'IVA è composta da una matrice morbida, può essere facilmente digerita con la collagenasi di tipo II. Questa procedura evita la dissociazione impropria dei tessuti perché questo enzima interrompe il collagene nativo della matrice extracellulare, rilasciando molte più cellule dallo stroma fibroso, con un impatto trascurabile sulla vitalità cellulare, sulla resa cellulare e sull'espressione della differenziazione dei cluster 19,27,28,29.
In termini di digestione enzimatica, è anche essenziale considerare la concentrazione enzimatica, il periodo di digestione e i parametri di centrifugazione per progettare un protocollo adeguato per l'isolamento di adipociti maturi e cellule SVF da VAT perché questi fattori possono influire sul fenotipo cellulare, sul recupero e sulla vitalità nella sospensione cellulare finale27,29. L'uso della collagenasi come enzima proteolitico è ideale a basse concentrazioni [range da 0,075% a 0,3% (p/v)], con un periodo di incubazione inferiore a 2 h, in modo che le caratteristiche fenotipiche e funzionali della SVF come il tasso di proliferazione, la capacità di differenziamento e la frequenza di specifiche linee cellulari, rimangano inalterate30,31. Utilizziamo un periodo di digestione massimo di 60 minuti e lo 0,25% di collagenasi, riducendo la concentrazione e la durata dell'esposizione alla collagenasi per ottenere un impatto trascurabile sulla vitalità cellulare e sull'espressione dei marcatori di superficie delle cellule SVF, evitando risultati distorti nell'analisi della citometria a flusso. Includiamo anche fasi di centrifugazione delicate e tempi di centrifugazione più brevi di 200 g/5 min per migliorare il recupero cellulare durante la separazione delle cellule adipose, rappresentando un vantaggio per il protocollo, poiché periodi di centrifugazione lunghi e intensi [superiori a 400 g/1 min] aumentano la morte degli adipociti, limitando la resa cellulare 32,33,34. Il recupero cellulare SVF ottenuto attraverso il protocollo di digestione a base di collagenasi è simile alle rese tipiche di 2-6 x 106 cellule/g AT riportate in letteratura, mentre la vitalità SVF di 63,9 ± 2,0 è moderatamente inferiore alla soglia minima proposta del 70%-80% per questo tipo di cellule 35,36,37,38. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che non utilizziamo terreni di coltura per risospendere le cellule SVF come protocolli standard, dal momento che caratterizziamo la popolazione di macrofagi attraverso i loro marcatori di superficie, ed è stato riportato che queste cellule mostrano una notevole plasticità in risposta alle condizioni ambientali, cambiando anche il loro fenotipo 39,40,41.
Inoltre, è anche importante ricordare che le donne in gravidanza incluse in questo protocollo come donatrici di VAT erano sane, senza evidenza clinica di comorbilità metaboliche, normale aumento di peso durante la gravidanza, età media 20-25 anni e indice di massa corporea pregestazionale normale (BMI 18,5-24,9 kg/m2; n = 7), perché alcuni autori hanno descritto che diversi donatori, età, BMI e sesso o etnia hanno un'influenza sul numero di cellule e sull'espressione dei marcatori di superficie SFV 42,43,44.
D'altra parte, l'analisi del profilo di espressione genica richiede quantità ragionevoli di RNA intatto, ma il suo isolamento dagli adipociti maturi è particolarmente difficile perché queste cellule hanno un contenuto lipidico più elevato e, in alcuni casi, il numero di cellule è basso 45,46,47,48. Abbiamo ottimizzato una procedura di isolamento dell'RNA da adipociti maturi basata su un metodo standard di isociocianato di guanidina/fenolo49,50, implementando semplici passaggi che consentono di eliminare lipidi e detriti cellulari. Dopo la preparazione del campione, l'estrazione dell'RNA su colonna ci consente di ottenere un RNA privo di DNA di alta qualità, compresi i microRNA, il che è abbastanza insolito per i campioni AT. La verifica della purezza e dell'integrità di questi RNA attraverso un analizzatore di controllo della qualità dell'RNA basato sulla microfluidica garantisce che la qualità dell'RNA isolato sia appropriata per le applicazioni a valle come i saggi RT-qPCR e i microarray di espressione.
Oltre ai vantaggi menzionati in precedenza, la digestione AT mediante collagenasi consente di liberare contemporaneamente gli adipociti e le cellule immunitarie residenti, mantenendo l'integrità dei recettori di superficie cellulare; questo è un fatto importante durante l'isolamento delle cellule SVF per ottenere dati di citometria a flusso affidabili e interpretabili27. Inoltre, le cellule isolate da tessuti carichi di lipidi come il VAT tendono ad essere più inclini all'aggregazione, riducendo la resa cellulare ordinata e aumentando l'autofluorescenza51. Nel protocollo, l'eliminazione di questi aggregati cellulari mediante filtrazione attraverso tre strati di garza prima della cernita e la loro esclusione con la strategia di gating descritta, riducono al minimo la fluorescenza di fondo, migliorando la qualità del campione per la selezione cellulare.
Precedenti studi sono stati condotti per identificare le cellule presenti nella SVF utilizzando un singolo set di marcatori CD caratteristici per queste cellule 52,53,54,55,56,57,58,59. Per una caratterizzazione più approfondita dei sottotipi di macrofagi in VAT SVF, abbiamo classificato queste cellule in base all'espressione di specifici marcatori di superficie cellulare. Secondo l'espressione dei marcatori CD45 e CD14 utilizzati per identificare le cellule di lignaggio monocita/macrofagiche in VAT60, abbiamo scoperto che questo tessuto è composto da una tipica popolazione di macrofagi CD45+CD14+ di origine ematopoietica. Utilizzando lo stesso protocollo, in uno studio precedente siamo stati in grado di caratterizzare le popolazioni di macrofagi M1 (CD11c) e M2 (CD163 e CD206)20.
La fenotipizzazione dei macrofagi all'interno dell'AT è stata classificata come uno spettro che va dai macrofagi pro-infiammatori (M1 classicamente attivati) ai macrofagi anti-infiammatori (M2 attivati in alternativa) in base alla presenza di diversi marcatori di attivazione sulla sua superficie61,62. Il marcatore macrofagico HLA-DR riflette il grado di attivazione dei macrofagi63,64 ed è stato incorporato nel protocollo per stabilire il fenotipo M1 o M2: le popolazioni di macrofagi che esprimono HLA-DR+ sono infiammatorie e HLA-DR- rappresentano macrofagi non infiammatori. Quindi, sulla base dell'espressione dei marcatori HLA-DR, sono stati definiti due sottogruppi di macrofagi: CD45+CD14+HLA-DR- e CD45+CD14+HLA-DR+, che originano dai monociti circolanti e meglio noti come macrofagi derivati dai monociti all'interno del tessuto adiposo65,66.
Inoltre, abbiamo quantificato CD11c (marcatore M1), così come CD163 e CD206 (marcatore M2) su ciascun sottotipo di macrofagi, determinando che i macrofagi AT mostrano tutti i marcatori di attivazione valutati sulla loro superficie di membrana, dimostrando che i macrofagi presenti in VAT da donne in gravidanza hanno caratteristiche più complesse di quelle descritte per le classificazioni eccessivamente semplificate delle popolazioni di macrofagi M1 e M2. Quindi, l'applicazione della citometria a flusso di base con pannello anticorpale multicolore e un rigoroso gating cellulare consente di identificare e caratterizzare i macrofagi dal pool eterogeneo di cellule nella SVF. La raffinata fenotipizzazione dei macrofagi ottenuta con il protocollo può essere utile negli studi condotti per chiarire i cambiamenti dinamici delle popolazioni di macrofagi nell'AT che portano a disturbi nell'omeostasi dell'AT.
Sebbene questo protocollo sia stato progettato per caratterizzare i macrofagi VAT, gli aggiustamenti apportati nel pannello anticorpale potrebbero espandere le sue applicazioni per facilitare lo smistamento di altre cellule immunitarie che risiedono nell'AT, poiché sono disponibili numerosi anticorpi fluorescenti per identificare marcatori specifici di diverso lignaggio. Inoltre, il metodo consente di utilizzare le popolazioni cellulari purificate mediante cell sorting per analisi post-sorting come l'estrazione di DNA/RNA/proteine o trattamenti ex vivo , ottenendo le cellule direttamente in un terreno appropriato con tecniche di sterilità.
In sintesi, riteniamo che il protocollo qui descritto rappresenti il compromesso più efficiente tra tempo, risorse, resa cellulare e vitalità cellulare, oltre ad essere altamente efficiente per l'estrazione di RNA e miRNA da cellule adipose e per la caratterizzazione della popolazione di macrofagi in AT.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dall'Instituto Nacional de Perinatologia (numeri di sovvenzione: 3300-11402-01-575-17 e 212250-3210-21002-06-15) e dal CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (numero di sovvenzione 2015-3-2-61661).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | - |
| 2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
| 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
| Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | - |
| Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | - |
| APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
| Baker | - | - | 250 ml, non sterile |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
| Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | - |
| Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
| Dissecting forceps | - | - | Steel, serrated jaws and round ends |
| Dissection tray | - | - | Stainless steel |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | - |
| FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | - |
| FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | - |
| FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | - |
| Manual cell counter | - | - | - |
| Mayo dissecting scisors | - | - | Stainless steel |
| Microcentrifuge | - | - | Adjustable temperature |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | - |
| Orbital shaker | - | - | Adjustable temperature and speed |
| P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
| P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
| P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
| P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
| PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | - |
| PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
| PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Pipette controller | - | - | - |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
| Refrigerated centrifuge | - | - | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
| Sterile Specimen container | - | - | - |
| Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
| Tube racks | - | - | For different tube sizes |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | - |
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