Summary
このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。
Abstract
内臓脂肪組織(VAT)は、主に成熟脂肪細胞と間質血管分(SVF)細胞で構成される活発な代謝器官であり、代謝、ホルモン、および免疫プロセスを制御するさまざまな生理活性分子を放出します。現在のところ、これらのプロセスが脂肪組織内でどのように制御されているかは不明です。したがって、脂肪組織の病態生理学に対する各細胞集団の寄与を評価する方法の開発は非常に重要です。このプロトコルでは、単離手順を説明し、コラゲナーゼ酵素消化技術を使用して、単一のプロセスでヒトVAT生検から生存可能な成熟脂肪細胞およびSVFを効率的に分離するために必要なトラブルシューティングガイドラインを提供します。さらに、プロトコルはまたマクロファージのサブセットを識別し、これらのセル集団間の相互作用を解剖する調査を行うことを可能にする遺伝子発現の調査のための成熟した脂肪細胞のRNAの隔離を行うために最大限に活用される。簡単に言うと、VAT生検を洗浄し、機械的に細かく刻み、消化して単一細胞懸濁液を生成します。遠心分離後、成熟脂肪細胞は浮遊選鉱によりSVFペレットから単離されます。RNA抽出プロトコルは、下流の発現アッセイのために脂肪細胞からの総RNA(miRNAを含む)の高収率を保証します。同時に、SVF細胞を使用して、フローサイトメトリー解析を通じてマクロファージサブセット(炎症誘発性および抗炎症性表現型)を特徴付けます。
Introduction
白色脂肪組織は、脂肪細胞や脂肪細胞だけでなく、マクロファージ、制御性T細胞(Treg)としての免疫細胞、好酸球、前駆脂肪細胞、線維芽細胞からなる不均一な細胞集団を含む間質血管分画(SVF)と呼ばれる非脂肪細胞分画で構成されており、血管組織や結合組織に囲まれています1,2。.現在、脂肪組織(AT)は、アディポカイン、サイトカイン、マイクロRNAを介して代謝と炎症に関連する生理学的プロセスを調節する器官と見なされており、さまざまな細胞によって組織に生成および放出され、自己分泌、パラクリン、および内分泌の影響を受けます3,4。ヒトでは、白色脂肪組織は皮下脂肪組織(SAT)と内臓脂肪組織(VAT)で構成され、それらの間には重要な解剖学的、分子的、細胞的、および生理学的違いがあります2,5。SATはヒトのATの最大80%を占めていますが、VATは腹腔内、主に腸間膜と大網にあり、代謝的により活発です6。さらに、VATはメディエーターを分泌する内分泌器官であり、体重、インスリン感受性、脂質代謝、炎症に大きな影響を与えます。その結果、VATの蓄積は、腹部肥満や、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血圧、心血管疾患リスクなどの肥満関連疾患につながり、肥満関連死亡率のより良い予測因子となります6,7,8,9。
恒常性維持状態では、脂肪細胞、マクロファージ、およびその他の免疫細胞が協力して、抗炎症メディエーターの分泌を介してVAT代謝を維持します10。しかし、VATを過度に拡大すると、活性化T細胞、NK細胞、マクロファージの動員が促進されます。実際、除脂肪VATでは、マクロファージの比率は5%ですが、肥満ではこの比率が最大50%まで上昇し、マクロファージが抗炎症性から炎症誘発性の表現型に二極化し、慢性炎症環境を生成します10,11。
肥満のパンデミックの結果として、脂肪細胞生物学、エピジェネティクス、炎症、内分泌特性、細胞外小胞などの新興領域など、さまざまなVAT研究トピックを扱う驚くべき数の報告が発生しています8,10,12,13。しかし、VAT環境は脂肪細胞と常在マクロファージまたは到着マクロファージとの間のクロストークによって定義されますが、ほとんどの研究は1つの細胞集団のみに焦点を当てており、VATにおけるこれらの細胞の相互作用とその病態生理学的影響に関する情報はほとんどありません11,14。さらに、ATにおける脂肪細胞とマクロファージの相互作用に対処する貴重な研究は、in vivoプライミング条件を欠いた細胞株を使用して行われました11,14,15。VATにおけるこれらの細胞の相互作用または特定の寄与を解剖する適切な戦略では、VAT代謝を調節するin vivo特性を可能な限り類似したin vitroアッセイを実施するために、同じ脂肪生検から両方の細胞タイプを単離する必要があります。
ATを破壊する機械的力に基づく非酵素的解離法は、最小限の操作を保証しますが、酵素法と比較して細胞回収効率が低く、細胞生存率が低く、より多くの組織が必要になるため、SVF細胞を研究することを目的としている場合は使用できません16,17。.コラゲナーゼを用いた酵素消化は、WAT18などの線維組織のコラーゲンや細胞外マトリックスタンパク質を適切に消化できる穏やかな方法であり、トリプシンが効果がない、または損傷を与える場合によく使用される19。プロトコルはコラゲナーゼの酵素の消化力の技術を使用して単一のプロセスの人間のVATのバイオプシーから実行可能な成長した脂肪細胞そしてSVFのセルの有効な隔離のための基本的なトラブルシューティングの指針を、与える下流の表現の適用のためのmicroRNAsを含む成長した脂肪細胞からの総RNAの高収率(量、純度および完全性)を、保障するために情報を提供する。同時に、プロトコルは、フローサイトメトリー20によるさらなる分析のために、複数の膜結合マーカーの染色を通じてSVF細胞からのマクロファージサブセットを識別するように最適化されています。
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Protocol
このプロトコルは、Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15) の IRB によって承認されました。参加は任意であり、登録されたすべての女性がインフォームドコンセントフォームに署名しました。
1. 内臓脂肪組織採取
- 分娩のない正期産の単胎妊娠の健康な成人女性から帝王切開中の部分的大網切除術を通じてVAT生検を取得します。
- 子宮閉鎖と止血の後、大網を特定し、湿式湿布で伸ばします。露出しているATはVATです。
- 最大の血管を見つけ、7 x 5 cmの架空の線を大網の基部までたどります。
- 無血管帯を特定し、ケリー鉗子を使用してVATの外側にドリルで穴を開けます。
- オクスナー鉗子を使用して、VATが穿たれたゾーンの近位側と遠位側をクランプし、メッツェンバウムのはさみを使用して組織を切断します。
- 大網を黒い絹の番号1で結びます。
- オクスナー鉗子を取り外し、止血を評価します。
- VAT生検を滅菌容器に入れ、すぐにラボに輸送します。
2. 内臓脂肪組織の酵素消化と成熟脂肪細胞および間質血管分画細胞の単離
- VAT生検を秤量し、1x PBS(pH 7.4)ですすぎます。
- 付加価値税4gを切り取り、はさみを使って解剖トレイで組織を細かく刻みます。
- みじん切りにしたVATを滅菌済みの50 mL遠心チューブに移し、20 mLのPBSを加え、穏やかに振とうして余分な赤血球を取り除きます。
- PBSを破棄し、手順を2回繰り返します。
- VATを新しい滅菌済み50 mL遠心チューブに移し、25 mLの消化溶液(0.25%コラゲナーゼII型、5 mMグルコース、1.5%アルブミン含有PBS)を加えます。
- 37°C、125rpmのオービタルシェーカーで60分間インキュベートします。
- 消化した組織を3層のガーゼでろ過し、新しい滅菌50 mL遠心チューブに入れます。
- 4°Cで5分間、200 x g で遠心分離します。
- 成熟脂肪細胞に対応する上相の2つの相が得られ、SFV細胞はペレット内に残ります。トランスファーピペットを使用して、成熟脂肪細胞を新しい滅菌済み50 mL遠心チューブに静かに移します。
- 20 mLの冷たいPBSを加え、穏やかに振とうし、200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- PBSを破棄し、手順を2回繰り返します。
- トランスファーピペットを使用して、成熟脂肪細胞を1.5 mLのDNase-RNaseフリー微量遠心チューブに静かに移します。
- 200 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離し、P200 マイクロピペットを使用して余分な PBS を除去します。必要に応じて、この手順を繰り返します。
- 300 μLの成熟脂肪細胞懸濁液を1.5 mLのDNase-RNaseフリー微量遠心チューブに静かに移します。成熟脂肪細胞は、RNA抽出まで-80°Cで保存してください。
注:脂肪細胞はペレットを形成しません。 - 脂肪細胞が分離されたら(ステップ2.9)、SVFペレットをチューブの底に置いたまま、ほとんどの消化液をトランスファーピペットで吸引します。
- トランスファーピペットを使用して、SVF細胞を含むペレットを新しい50 mL遠心チューブに移します。
- 細胞ペレットを穏やかに洗浄し、ピペッティングで上下させて20 mLの冷たい1x PBSに再懸濁します。
- 800 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を速やかに廃棄します。
- 手順2.17と2.18を繰り返して、2回目の洗浄を実行します。
- 室温(RT)に平衡化した赤血球溶解バッファー5 mLをSVFペレットに加え、ピペッティングを繰り返して懸濁します。ボルテックスしないでください。
- 室温で5分間インキュベートし、800 x gで5分間遠心分離します。トランスファーピペットを使用して上澄み液を慎重に除去し、適切に廃棄してください。
- 溶解バッファーを中和するには、10 mLの冷たい1x PBSを加え、細胞ペレットが解解するまで穏やかに混合します。
- 800 x g で5分間遠心分離してSVFペレットを得て、PBSを廃棄します。チューブの底に白いペレットが見えるはずです。
- 細胞を 5 mL の 1 x PBS に RT で繰り返しピペッティングして再懸濁し、3 層のガーゼでろ過して新しい 50 mL のコニカルチューブに入れます。その後、これらの細胞は、フローサイトメトリーによるマクロファージ亜集団の特性評価に使用されます。
3. 成熟脂肪細胞からのRNA抽出
- RNAの分解を防ぐために、RNase除染スプレーを使用してクリーンな領域を準備します。RNA手順用に予約されたピペットのセットを使用してください。使用するチューブとチップはすべてRNaseフリーである必要があります。
- 成熟脂肪細胞懸濁液(セクション2.14)を-80°Cで保存した場合は、4°Cで解凍します。
注意: 複数回の凍結融解サイクルは避けてください。 - 1,000 μLの酸-グアニジニウム-フェノールベースの試薬を添加して細胞を溶解し、P1000マイクロピペットで完全に混合してホモジナイズします。
- 室温で5分間インキュベートして、核タンパク質複合体の解離を促進します。
- 細胞ライセートを室温で12,000 x g で5分間遠心分離します。脂肪細胞脂質に対応する上相(黄色)、核酸に対応する中期(ピンク)、ペレット(細胞破片)の3つの相が得られます。
- P200マイクロピペットを使用して、脂質層を慎重に除去します。
- 脂質残渣やペレットの乱れを避けながら、中間相を新しい 2 mL チューブに移します(約 700 μL)。
4. マイクロRNAを含むトータルRNAの精製
注:高品質のトータルRNAを得るには、カラムベースのトータルRNA精製法を使用します。
- セクション3.7のサンプルに等量のエタノール(95%〜100%)、約700 μLを加え、チューブを10秒間反転させて手で混合します。
- 混合物700μLをコレクションチューブに挿入したカラムに移し、遠心分離してフロースルーを廃棄します。
- 列をリロードし、手順4.2を繰り返します。
- カラムを新しいコレクションチューブに移します。
- 400 μL のプレウォッシュバッファーをカラムに加え、遠心分離します。フロースルーを破棄し、この手順を繰り返します。
- 700 μL の洗浄バッファーをカラムに加え、遠心分離機で 2 分間加熱します。
- カラムをヌクレアーゼフリーチューブに慎重に移します。
- 50 μL のヌクレアーゼフリー水をカラムマトリックスに直接添加し、遠心分離により RNA を溶出します。200 μLのマイクロチューブを使用して10 μLのアリコートを調製します。
- すぐにアリコートを氷の上に置き、そのうちの1つを使用してRNAの濃度と純度を測定します。
- 100 ng/μL に調整した 5 μL のトータル RNA のアリコートを調製して、RNA の完全性と microRNA 濃度を測定します。
- 使用するまで-80°Cで保管してください。
5.成熟脂肪細胞RNA濃度、純度、および完全性の決定。microRNA定量アッセイ
注:RNA濃度と純度の測定は、UV-Vis分光光度計を使用して行われます。RNAの完全性とmiRNAの定量は、RNA品質管理分析装置を使用して行われます。
- サンプルリーダーを分子グレードの水で洗浄し、拭き取ります。
- 2 μLの溶出水(ブランク)をロードし、設定をRNAに変更し、 ブランク ボタンをクリックします。
- 2 μL のサンプルをロードし、[ 測定 ]ボタンをクリックします。
- 読み取りが完了したら、A260/A280 および A260/A230 の比率と RNA の量(ng/μL)を記録します(図 1A)。
注:OD260 / OD280およびOD260 / OD230比が約2.0のRNAは純粋と見なされます。 - メーカーの指示に従い、RNA インテグリティキットを使用して RNA インテグリティナンバー(RIN)を測定します(図 1B)。
注:RIN =10 はインタクト RNA に対応し、RIN ≤ 3.0 は RNA が強く分解されていることを示します。発現マイクロアレイまたはRT-qPCRには、RIN ≥ 6.0のRNAを使用します。 - メーカーの指示に従って、small RNA キットを使用してマイクロ RNA の濃度と割合を測定します(図 1C)。
注:低分子RNAおよびマイクロRNAの過大評価を避けるため、RIN ≥ 6.0のRNAサンプルを使用してください。
6. 間質血管分画細胞の数と生存率
- 10 μLのSVF細胞懸濁液(セクション2.24)を90 μLの0.4%トリパンブルー溶液(最終希釈1:10)に希釈し、10 μLを標準的な血球計算盤に適用します。
- 死んだ細胞を除いて、生細胞を計数チャンバーの隅にある4つの正方形に注意深く数えます。
- 元の懸濁液中に存在する細胞濃度を測定:細胞濃度 = 総細胞数/4 x 希釈係数(10) x 10,000 = 細胞/mL
- 得られた細胞収量(組織グラム当たりの細胞数)を計算するには、細胞濃度に元の総サンプル量(mL)を掛け、消化した組織の重量(グラム単位)で割ります。
- 細胞生存率を生細胞の割合として次のように評価します:生存率 = (生細胞数 / 細胞総数) x 100。
7. 間質血管分画からのマクロファージサブセットのキャラクタリゼーション
- 合計1 x 106 SVF細胞/mLを5 mLの丸底ポリプロピレン製試験管に移し、800 x g で4°Cで5分間遠心分離し、フローサイトメトリーおよびペレット細胞をペレット化します。
- ボルテックスしてペレットをほぐし、細胞を100 μLの1x PBSに室温で再懸濁します。
- 細胞表面抗原に特異的な各蛍光色素標識モノクローナル抗体の滴定済み最適濃度を追加します。穏やかに混合し、室温で暗所で15分間インキュベートします。
- 過剰の冷たい1x PBS(≈ 1 mL)を加え、SVFを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
- デカンテーションにより上清を速やかに廃棄する。ペレットを乱さないように注意してください。
- 500 μL の 1x 溶解溶液を添加し、室温で 15 分間インキュベートし、チューブを直射日光から保護します。
- 4°Cで400 x g で5分間遠心分離した後、溶液を除去し、データが取得されるまで暗所で2〜8°Cで保存します。
- 細胞を低速で完全にボルテックスして凝集を減らしてから取得します。
- SVFペレットを室温で5 mLのシース液に再懸濁し、その後、フローサイトメトリーで分析する前に、3層のガーゼを新しい5 mLの丸底ポリプロピレン試験管にろ過して、セルソーターラインの詰まりを減らします。
- 分析前に各チューブを短時間ボルテックスします。
- 対象サンプルからデータを取得します。フロー分析では、少なくとも 10,000 個のイベントをカウントします。
注:セルソーティングフローサイトメーターを使用する場合は、マクロファージを分離して、その後の研究に適用してください。
8. ゲーティング戦略
- 前方散乱分布(FSC)の面積に対して高さまたは幅をプロットし、一重項母集団を決定します(図2A)。
- FSCに対する側方散乱(SSC)の領域をプロットし、細胞破片を廃棄する細胞を選択します(図2B)。
- 選択した細胞から、CD45を造血細胞として発現する集団(図2C)を同定し、CD45/CD14二重陽性細胞をマクロファージとして発現する集団を同定します(図2D)。
- CD45+/CD14+マクロファージから、陰性および陽性のHLA-DR細胞を検出します(図2E)。
注:抗体パネルのコンペンセーションコントロールを含め、パネルに適したマルチカラーフローサイトメーターでスペクトルオーバーラップを調整します。3つのレーザー(405 nm紫色レーザー、488 nm青色レーザー、640 nm赤色レーザー)を搭載したサイトメーターと、指示された蛍光色素の検出器を用いてフローサイトメトリー解析を行います。
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Representative Results
このプロトコルは部分的なomentectomyの後で健康な妊婦から得られるVATのバイオプシーから、単一のプロセスで、実行可能な成熟した脂肪細胞およびSVFのセルを隔離するために差動遠心分離に続くコラゲナーゼの消化力を使用して酵素方法を記述する。この場合、RNA抽出には脂肪細胞を、マクロファージ表現型にはSVFを使用します。
RNA抽出プロトコルにより、成熟脂肪細胞から十分な純度、高完全性、およびマイクロRNAを得ることができました(図1)。RNA品質管理分析装置によって評価されたRNAの完全性は、プロトコルで単離された脂肪細胞のサンプルに対して優れた値をもたらしました(RIN = 9.7)。
VAT-SVF中に存在する有核細胞の総数は、VAT約2.8 x 106 細胞/g(2.8 x 106 ± 1.7 x 106)であり、トリパンブルー除外試験では生存率は64%(63.9 ± 2.0)でした。SVF細胞を蛍光色素標識一次抗体で標識し、蛍光活性化セルソーティング分析によりATマクロファージを同定および特性評価しました。フローサイトメトリー解析では、細胞マーカーに基づいて異なる細胞集団を示すプロットが生成されます(図2)。最初に、前方散乱面積(FSC-A)と前方散乱高さ(FSC-H)をプロットすることにより、細胞凝集体を分析から簡単に除去できました(図2A)。次に、前方散乱領域(FSC-A)および側方散乱領域(SSC-A)を使用して、正しいサイズと複雑さに基づいて細胞をゲーティングすることにより、細胞破片を除外しました(図2B)。次に、マクロファージを解析するために、他の免疫細胞を排除する必要はありませんでした。まず、CD45およびCD14マーカーを使用して単球/マクロファージ系統細胞を選択しました(図2C、D)。続いて、CD45/CD14の二重陽性細胞をマクロファージマーカーHLA-DR発現に基づいて分離し、HLA-DRおよび HLA-DR+ の2つのサブセットマクロファージを同定しました(図2E)。
図1:成熟脂肪細胞からのRNA品質管理。 (A)RNA濃度、260/280、および260/230比。(B) 完全性分析。エレクトロフェログラム、ゲル画像、およびRNA完全性数は、RNA品質管理分析装置およびRNA分析キットを使用して取得しました。(C)マイクロRNAの定量。エレクトロフェログラム、ゲルイメージ、およびマイクロRNAパーセントは、RNA品質管理分析装置とsmall RNAキットを使用して取得しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:内臓脂肪組織からのマクロファージの同定。 コラゲナーゼ消化法を用いた帝王切開中に採取された内臓脂肪組織から単離された間質血管分画マクロファージの代表的なフローサイトメトリープロット。(A)第1前方散乱光領域(FSC-A)とFSC高さ(FSC-H)ゲートを使用してダブレットを除去するシングレットの同定。(B)2番目の前方散乱領域(FSC-A)と側方散乱領域(SSC-A)ゲートを使用して、サイズと密度に基づいてデブリを除去しました。(C、D)SSC-AとCD45ゲートは造血起源の細胞を同定し、SSC-AとCD14はマクロファージを同定しました。(E)総CD45+/CD14+マクロファージをHLA-DRマーカーに基づいてゲーティングし、マクロファージの2つのサブセット(HLA-DRおよび HLA-DR+)を同定した。プロットは、個々の被験者の代表的なデータを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
VATは、代謝調節と炎症に重要な役割を果たします。肥満に伴う慢性炎症における脂肪細胞と免疫細胞の役割への関心の高まりにより、ATに存在するSVF細胞と脂肪細胞を分離するためのさまざまな技術が開発されています。しかし、ほとんどの技術では、脂肪細胞とSVF細胞の相互作用に関する研究に不可欠な、同じVAT生検から下流のアプリケーションに有効なこれら2つの異なる細胞セットを1回の手順で得ることはできません。したがって、VAT生検に存在する生存可能な成熟脂肪細胞とSVF細胞を分離するための詳細な説明を提供するこのプロトコルを実装しました。これは、組織消化とコラゲナーゼ濃度の時間、および細胞分離のための遠心分離の時間と速度において以前の報告とは異なり、適切な脂肪細胞RNA収量と詳細なマクロファージサブセットの特性評価を可能にします。
AT由来細胞の酵素的および非酵素的単離技術が多数提案されており、単離された細胞の生物学的特性および機能特性に異なる影響を与える17,21,22,23,24ため、追求する目的に応じて最も適切な戦略を選択する必要があります。多くの場合、脂肪組織からの成熟脂肪細胞およびSVFの単離は、組織解離酵素25、26、27を用いて達成される。ATの解離にはさまざまな酵素を使用できますが、コラゲナーゼによる酵素消化は、この組織を消化するためのゴールドスタンダードとして残っています27,28。VATはソフトマトリックスで構成されているため、コラゲナーゼII型で容易に消化できます。この手順は、この酵素が細胞外マトリックスの天然コラーゲンを破壊し、線維性間質からより多くの細胞を放出し、細胞生存率、細胞収量、およびクラスター分化発現に無視できる影響を与えるため、不適切な組織解離を回避します19,27,28,29。
酵素消化に関しては、酵素濃度、消化期間、および遠心分離パラメータを考慮して、これらの要因が最終的な細胞懸濁液中の細胞表現型、回収率、および生存率に影響を与える可能性があるため、VATから成熟脂肪細胞およびSVF細胞を分離するための適切なプロトコルを設計することも不可欠です27,29.タンパク質分解酵素としてのコラゲナーゼの使用は、インキュベーション期間が2時間未満の低濃度[範囲0.075%a 0.3%(w / v)]で理想的であるため、特定の細胞系統の増殖速度、分化能、頻度などの表現型および機能SVF特性は変化しません30,31。最大消化期間60分、0.25%コラゲナーゼを使用し、コラゲナーゼ曝露の濃度と長さを低減して、細胞生存率とSVF細胞表面マーカーの発現への影響をほとんど与えず、フローサイトメトリー解析での結果の歪みを回避します。また、脂肪細胞分離時の細胞回収率を向上させるために、穏やかな遠心分離ステップと200 g/5分の短い遠心分離時間も含んでおり、長くて激しい遠心分離期間[400 g/1分以上]は脂肪細胞の死を増加させ、細胞収量を制限するため、プロトコルの利点を表しています32,33,34.コラゲナーゼベースの消化プロトコルによって達成されるSVF細胞回収率は、文献で報告されている2–6 x 106 cells/g ATの典型的な収量と同様であるのに対し、63.9 ± 2.0のSVF生存率は、これらのタイプの細胞で提案されている最小閾値である70%–80%よりもやや低い35,36,37,38.これは、マクロファージ集団を表面マーカーで特徴づけるため、標準プロトコルとしてSVF細胞の再懸濁に培地を使用していないためと考えられますが、これらの細胞は環境条件に応答して顕著な可塑性を示し、表現型を変化させることが報告されています39,40,41。
さらに、VATドナーとしてこのプロトコルに含まれる妊婦は健康であり、代謝性併存疾患、妊娠中の正常な体重増加、平均年齢20〜25歳、および正常な妊娠前ボディマス指数(BMI 18.5〜24.9 kg / m2;何人かの著者は、異なるドナー、年齢、BMI、性別または民族性が細胞数、およびSFV表面マーカーの発現に影響を与えると説明しているためである42,43,44。
一方、遺伝子発現プロファイル解析には、適度な量のインタクトRNAが必要ですが、成熟脂肪細胞は脂質含有量が高く、場合によっては細胞数が少ないため、成熟脂肪細胞からの単離は特に困難です45,46,47,48。標準的なグアニジンイソチオシアネート/フェノール法49,50に基づいて成熟脂肪細胞からのRNA分離手順を最適化し、脂質と細胞破片を除去できる簡単な手順を実装しました。サンプル調製後、カラムベースのRNA抽出により、ATサンプルでは非常に珍しいマイクロRNAを含む高品質のDNAフリーRNAを得ることができます。マイクロ流体ベースのRNA品質管理分析装置によるこれらのRNAの純度と完全性の検証により、単離されたRNAの品質がRT-qPCRアッセイや発現マイクロアレイなどのダウンストリームアプリケーションに適していることが保証されます。
前述の利点に加えて、コラゲナーゼを使用したAT消化は、脂肪細胞と常在免疫細胞を同時に遊離させ、細胞表面受容体の完全性を維持することができます。これは、信頼性が高く解釈可能なフローサイトメトリーデータを得るために、SVF細胞単離中に重要な事実です27。さらに、VATなどの脂質を含む組織から単離された細胞は凝集しやすい傾向があり、選別された細胞収量が減少し、自家蛍光が増加します51。プロトコルでは、分類の前にガーゼの3つの層を通したろ過によってこれらの細胞凝集物の除去および記述されていたゲートで制御の作戦との排除は、細胞分類のためのサンプル質を改善する背景の蛍光を最小にする。
以前の研究は、これらの細胞に特徴的な単一のCDマーカーセットを使用してSVFに存在する細胞を同定するために行われてきました52、53、54、55、56、57、58、59。VAT SVFにおけるマクロファージサブタイプのより詳細な特性評価のために、これらの細胞を特定の細胞表面マーカーの発現によって分類しました。VAT60の単球/マクロファージ系統細胞の同定に用いられたCD45およびCD14マーカーの発現によると、この組織は造血起源の典型的なCD45+CD14+ マクロファージ集団で構成されていることがわかった。同じプロトコルを使用して、以前の研究では、M1(CD11c)およびM2(CD163およびCD206)マクロファージ集団を特徴付けることができました20。
AT内のマクロファージ表現型は、その表面上の異なる活性化マーカーの存在に応じて、炎症誘発性マクロファージ(古典的に活性化された-M1)から抗炎症性マクロファージ(または活性化された-M2)までのスペクトルとして分類されている61,62。HLA-DRマクロファージマーカーはマクロファージ活性化度63,64を反映し、M1またはM2表現型を確立するためにプロトコルに組み込まれました:HLA-DR+を発現するマクロファージ集団は炎症性であり、HLA-DR-は非炎症性マクロファージを表します。そこで、HLA-DRマーカーの発現に基づいて、マクロファージの2つのサブセットが定義されました:CD45 + CD14 + HLA-DR-およびCD45 + CD14 + HLA-DR+は、循環する単球に由来し、脂肪組織内の単球由来のマクロファージとしてよく知られています65,66。
さらに、各マクロファージサブタイプのCD11c(M1マーカー)、CD163およびCD206(M2マーカー)を定量し、ATマクロファージが膜表面に評価されたすべての活性化マーカーを示すことを決定し、妊婦のVATに存在するマクロファージは、M1およびM2マクロファージ集団の過度に単純化された分類について記述されたものよりも複雑な特性を持っていることを実証しました。したがって、マルチカラー抗体パネルとストリンジェントセルゲーティングを備えた基本的なフローサイトメトリーを適用することで、SVF内の不均一な細胞プールからマクロファージを同定し、特性評価することが可能になります。プロトコルで得られた洗練されたマクロファージ表現型は、ATホメオスタシスの乱れにつながるATのマクロファージ集団の動的変化を解明するために実施される研究で有用です。
このプロトコルはVATマクロファージを特徴付けるために設計されましたが、抗体パネルで行われた調整により、異なる系統の特定のマーカーを同定するために多数の蛍光抗体が利用できるため、ATに存在する他の免疫細胞の選別を容易にするためにその用途が拡大する可能性があります。さらに、この方法では、セルソーティングによって精製された細胞集団を、DNA/RNA/タンパク質抽出や ex vivo 処理などのソーティング後の分析に使用でき、無菌技術で適切な培地に直接細胞を得ることができます。
要約すると、本明細書に詳述するプロトコールは、脂肪細胞からのRNAおよびmiRNAの抽出、およびATにおけるマクロファージ集団の特性評価において非常に効率的であることに加えて、時間、リソース、細胞収量、および細胞生存率の間の最も効率的なトレードオフを表していると考えています。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
本研究は、Instituto Nacional de Perinatologia(助成金番号:3300-11402-01-575-17および212250-3210-21002-06-15)およびCONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social(FOSISS)(認可番号2015-3-2-61661)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | - |
| 2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
| 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
| Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | - |
| Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | - |
| APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
| Baker | - | - | 250 ml, non sterile |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
| Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | - |
| Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
| Dissecting forceps | - | - | Steel, serrated jaws and round ends |
| Dissection tray | - | - | Stainless steel |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | - |
| FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | - |
| FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | - |
| FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | - |
| Manual cell counter | - | - | - |
| Mayo dissecting scisors | - | - | Stainless steel |
| Microcentrifuge | - | - | Adjustable temperature |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | - |
| Orbital shaker | - | - | Adjustable temperature and speed |
| P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
| P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
| P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
| P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
| PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | - |
| PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
| PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Pipette controller | - | - | - |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
| Refrigerated centrifuge | - | - | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
| Sterile Specimen container | - | - | - |
| Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
| Tube racks | - | - | For different tube sizes |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | - |
References
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