Summary
Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.
Abstract
O tecido adiposo visceral (TAV) é um órgão metabólico ativo composto principalmente por adipócitos maduros e células da fração vascular estromal (FRS), que liberam diferentes moléculas bioativas que controlam processos metabólicos, hormonais e imunológicos; Atualmente, não está claro como esses processos são regulados dentro do tecido adiposo. Portanto, o desenvolvimento de métodos que avaliem a contribuição de cada população celular para a fisiopatologia do tecido adiposo é crucial. Este protocolo descreve as etapas de isolamento e fornece as diretrizes de solução de problemas necessárias para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e SVF de biópsias de TAV humano em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase. Além disso, o protocolo também é otimizado para identificar subgrupos de macrófagos e realizar isolamento de RNA de adipócitos maduros para estudos de expressão gênica, o que permite a realização de estudos dissecando a interação entre essas populações celulares. Resumidamente, as biópsias de IVA são lavadas, picadas mecanicamente e digeridas para gerar uma suspensão de célula única. Após a centrifugação, adipócitos maduros são isolados por flutuação do pellet de SVF. O protocolo de extração de RNA garante um alto rendimento de RNA total (incluindo miRNAs) de adipócitos para ensaios de expressão a jusante. Simultaneamente, as células SVF são usadas para caracterizar subtipos de macrófagos (fenótipo pró e anti-inflamatório) por meio da análise por citometria de fluxo.
Introduction
O tecido adiposo branco é composto não apenas por células adiposas ou adipócitos, mas também por uma fração de células não adiposas conhecida como fração vascular estromal (FVS), que contém uma população celular heterogênea constituída por macrófagos, outras células imunes como células T reguladoras (Tregs), eosinófilos, pré-adipócitos e fibroblastos, circundados por tecido vascular e conjuntivo 1,2. O tecido adiposo (TA) é hoje considerado um órgão que regula processos fisiológicos relacionados ao metabolismo e à inflamação por meio de adipocinas, citocinas e microRNAs produzidos e liberados por diferentes células no tecido, com efeitos autócrinos, parácrinos e endócrinos 3,4. Em humanos, o tecido adiposo branco compreende o tecido adiposo subcutâneo (TAS) e o tecido adiposo visceral (TAV), com importantes diferenças anatômicas, moleculares, celulares e fisiológicas entre eles 2,5. O TSA representa até 80% do TA humano, enquanto o TAA localiza-se dentro da cavidade abdominal, principalmente no mesentério e omento, sendo metabolicamente maisativo6. Além disso, o TAV é um órgão endócrino que secreta mediadores com impacto substancial no peso corporal, sensibilidade à insulina, metabolismo lipídico e inflamação. Consequentemente, o acúmulo de TAV leva à obesidade abdominal e a doenças relacionadas à obesidade, como diabetes tipo 2, síndrome metabólica, hipertensão e risco de doença cardiovascular, representando um melhor preditor de mortalidade associada à obesidade 6,7,8,9.
Em condições homeostáticas, adipócitos, macrófagos e outras células imunes cooperam para manter o metabolismo do LV através da secreção de mediadores anti-inflamatórios10. No entanto, a expansão excessiva do TAV promove o recrutamento de células T ativadas, células NK e macrófagos. De fato, no LV magro, a proporção de macrófagos é de 5%, enquanto na obesidade essa relação sobe até 50%, com polarização dos macrófagos do fenótipo anti-inflamatório para o pró-inflamatório, gerando um ambiente inflamatório crônico10,11.
Como consequência da pandemia de obesidade, um número surpreendente de relatos tem surgido abordando diferentes tópicos de pesquisa em TAV, incluindo biologia de adipócitos, epigenética, inflamação, propriedades endócrinas, áreas emergentes como vesículas extracelulares, entre outros 8,10,12,13. No entanto, embora o ambiente de LV seja definido pelo crosstalk entre adipócitos e macrófagos residentes ou chegantes, a maioria dos estudos tem focado em apenas uma população celular, e há poucas informações sobre a interação dessas células no TAV e suas consequências fisiopatológicas11,14. Além disso, estudos valiosos abordando a interação adipócito-macrófago no TA foram realizados utilizando linhagens celulares, sem as condições de priming in vivo 11,14,15. Uma estratégia adequada para dissecar a interação ou a contribuição particular dessas células no TAV requer o isolamento de ambos os tipos celulares da mesma biópsia de gordura para realizar ensaios in vitro que espelhem o mais semelhante possível as propriedades in vivo que regulam o metabolismo do TAV.
Embora os métodos de dissociação não enzimática baseados em forças mecânicas para quebrar o TA garantam mínima manipulação, esses métodos não podem ser utilizados se o objetivo for estudar as células da FVS, pois apresentam menor eficiência na recuperação celular e baixa viabilidade celular em comparação aos métodos enzimáticos, sendo necessário maior volume de tecido16,17. A digestão enzimática com colagenase é um método suave que permite a digestão adequada do colágeno e das proteínas da matriz extracelular de tecidos fibrosos, como o WAT18, e é frequentemente utilizada quando a tripsina é ineficaz ou lesiva19. O protocolo fornece diretrizes fundamentais de solução de problemas para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias humanas de IVA em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase, fornecendo informações para garantir altos rendimentos (quantidade, pureza e integridade) de RNA total de adipócitos maduros, incluindo microRNAs, para aplicações de expressão a jusante. Simultaneamente, o protocolo é otimizado para identificar subtipos de macrófagos de células SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para posterior análise por citometria de fluxo20.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo CEP do Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). A participação foi voluntária e todas as mulheres inscritas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
1. Coleção de tecido adiposo visceral
- Obter biópsias de IVA através de omentectomia parcial durante cesariana de mulheres adultas saudáveis com gravidez única a termo sem trabalho de parto.
- Após o fechamento uterino e hemostasia, proceder à identificação do omento maior e estendê-lo em compressa úmida. O AT exposto é IVA.
- Localize o maior vaso sanguíneo e trace uma linha imaginária de 7 x 5 cm até a base do omento maior.
- Identifique uma zona avascular e use pinças Kelly para perfurar o lado externo do VAT.
- Use pinça de Ochsner para pinçar o lado proximal e distal na zona onde o IVA foi perfurado e use tesoura de Metzenbaum para cortar o tecido.
- Amarre o omento maior com seda preta número 1.
- Retirar a pinça de Ochsner e avaliar a hemostasia.
- Coloque a biópsia em um recipiente estéril e transporte-a para o laboratório imediatamente.
2. Digestão enzimática do tecido adiposo visceral e isolamento de adipócitos maduros e células da fração vascular estromais
- Pesar a biópsia de IVA e enxaguar com 1x PBS pH 7,4.
- Corte 4 g de IVA e use uma tesoura para picar o tecido em pequenos pedaços em uma bandeja de dissecção.
- Transfira o IVA picado para um tubo centrífugo estéril de 50 mL, adicione 20 mL de PBS e agite suavemente para remover o excesso de glóbulos vermelhos.
- Descarte o PBS e repita o procedimento duas vezes.
- Transfira o IVA para um novo tubo centrífugo estéril de 50 mL e adicione 25 mL de solução de digestão (colagenase tipo II a 0,25%, glicose a 5 mM, albumina a 1,5% em PBS).
- Incubar a 37 °C durante 60 min num agitador orbital a 125 rpm.
- Filtrar o tecido digerido através de três camadas de gaze para um novo tubo centrífugo estéril de 50 mL.
- Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
- Duas fases são obtidas, uma fase superior que corresponde aos adipócitos maduros, enquanto as células SFV permanecem na pelota. Transfira suavemente os adipócitos maduros para um novo tubo centrífugo estéril de 50 mL usando uma pipeta de transferência.
- Adicionar 20 ml de PBS frio, agitar suavemente e centrifugar a 200 x g durante 5 minutos a 4 °C.
- Descarte o PBS e repita o procedimento duas vezes.
- Use uma pipeta de transferência para transferir suavemente os adipócitos maduros para um tubo de microcentrífuga livre de DNase-RNase de 1,5 mL.
- Centrifugar a 200 x g durante 1 min a 4 °C e remover o excesso de PBS utilizando uma micropipeta P200. Repita esta etapa, se necessário.
- Transfira suavemente 300 μL de suspensão de adipócitos maduros para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sem DNase-RNase. Armazenar adipócitos maduros a -80 °C até a extração de RNA.
NOTA: Os adipócitos não formam uma pelota. - Uma vez separados os adipócitos (passo 2.9), aspirar a maior parte da solução de digestão com uma pipeta de transferência, mantendo o pellet de SVF no fundo do tubo.
- Transfira o pellet com células SVF para um novo tubo centrífugo de 50 mL usando uma pipeta de transferência.
- Lave suavemente o pellet celular, ressuspendendo em 20 mL de PBS 1x frio por pipetagem para cima e para baixo.
- Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar rapidamente o sobrenadante por decantação.
- Execute uma segunda lavagem repetindo as etapas 2.17 e 2.18.
- Adicionar 5 mL de tampão de lise de hemácias equilibrado à temperatura ambiente (TR) ao pastlet de SVF e suspender por pipetagem repetida. Não vórtice.
- Incubar por 5 min em TR e centrifugar por 5 min a 800 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de transferência e descarte corretamente.
- Para neutralizar o tampão de lise, adicione 10 mL de PBS 1x frio e misture suavemente até que o pellet celular se desapareça.
- Centrifugar a 800 x g por 5 min para obter o pellet SVF e descartar PBS. Um pellet branco deve ser visível na parte inferior do tubo.
- Ressuspender as células em 5 mL de PBS 1x em TR por pipetagem repetida e filtrada através de três camadas de gaze em um novo tubo cônico de 50 mL. Posteriormente, estas células serão utilizadas para caracterização da subpopulação de macrófagos por citometria de fluxo.
3. Extração de RNA de adipócitos maduros
- Prepare uma área limpa, usando spray de descontaminação de RNase para evitar a degradação do RNA. Use um conjunto de pipetas reservadas para procedimentos de RNA. Todos os tubos e pontas empregados devem ser livres de RNase.
- Descongelar a suspensão de adipócitos maduros (secção 2.14) a 4 °C se tiver sido armazenada a -80 °C.
NOTA: Evite vários ciclos de congelamento-descongelamento. - Lise as células adicionando 1.000 μL de reagente à base de ácido-guanidínio-fenol e misture completamente com uma micropipeta P1000 para homogeneizar.
- Incubar por 5 min em RT para aumentar a dissociação de complexos de nucleoproteínas.
- Centrifugar lisado celular por 5 min a 12.000 x g em TR. Serão obtidas três fases: uma fase superior (amarela) correspondente aos lipídios dos adipócitos, uma fase média (rosa) correspondente aos ácidos nucléicos e uma pelota (debris celulares).
- Retire cuidadosamente a camada lipídica, utilizando uma micropipeta P200.
- Transferir a fase intermediária para um novo tubo de 2 mL, evitando que o resquício lipídico e a pastilha perturbem (aproximadamente 700 μL).
4. Purificação do RNA total, incluindo microRNAs
NOTA: Um método de purificação de RNA total baseado em coluna é usado para obter RNA total de alta qualidade.
- Adicionar um volume igual de etanol (95%–100%) à amostra da secção 3.7, aproximadamente 700 μL, e misturar invertendo manualmente o tubo durante 10 s.
- Transferir 700 μL da mistura para uma coluna inserida num tubo de recolha, centrifugar e eliminar o fluxo.
- Recarregue a coluna e repita a etapa 4.2.
- Transfira a coluna para um novo tubo de coleta.
- Adicionar 400 μL de tampão de pré-lavagem à coluna e à centrífuga. Descarte o fluxo e repita esta etapa.
- Adicionar 700 μL de tampão de lavagem à coluna e centrifugar durante 2 min.
- Transfira a coluna cuidadosamente para um tubo livre de nucleases.
- Adicionar 50 μL de água livre de nucleases diretamente à matriz da coluna e eluir o RNA por centrifugação. Preparar alíquotas de 10 μL utilizando tubos de microfuga de 200 μL.
- Coloque imediatamente alíquotas no gelo e use uma delas para determinar a concentração e pureza do RNA.
- Preparar uma alíquota de 5 μL de RNA total ajustada para 100 ng/μL para medir a integridade do RNA e a concentração de microRNA.
- Conservar a -80 °C até à utilização.
5. Determinação da concentração, pureza e integridade do RNA dos adipócitos maduros; ensaio de quantificação de microRNA
NOTA: As determinações da concentração e pureza do RNA são realizadas usando um espectrofotômetro UV-Vis; A integridade do RNA e a quantificação do miRNA são realizadas usando um analisador de controle de qualidade de RNA.
- Lave o leitor de amostras com água de grau molecular e limpe.
- Carregue 2 μL de água de eluição (em branco), altere a configuração para RNA e clique no botão Em branco .
- Carregue 2 μL de amostra e clique no botão Medir .
- Após a conclusão da leitura, registre as relações A260/A280 e A260/A230, bem como a quantidade de RNA (ng/μL) (Figura 1A).
NOTA: RNA com OD260/OD280 e OD260/OD230 razão em torno de 2,0 é considerado puro. - Meça o número de integridade do RNA (NIR) usando um kit de integridade do RNA seguindo as instruções do fabricante (Figura 1B).
NOTA: UM RIN =10 corresponde ao RNA intacto, enquanto um RIN ≤ 3,0 indica um RNA fortemente degradado. Para microarrays de expressão ou RT-qPCR, utilizar RNA com RIN ≥ 6.0. - Use um pequeno kit de RNA para determinar a concentração e a porcentagem de microRNAs, seguindo as instruções do fabricante (Figura 1C).
NOTA: Para evitar a superestimação de pequenos e micro RNAs, use amostras de RNA com RIN ≥ 6.0.
6. Contagem e viabilidade de células da fração vascular estromal
- Diluir 10 μL da suspensão de células SVF (secção 2.24) em 90 μL de Solução de Azul de Tripano a 0,4% (diluição final 1:10) e aplicar 10 μL num hemocitómetro padrão.
- Conte cuidadosamente as células viáveis, excluindo as células mortas, em quatro quadrados no canto da câmara de contagem.
- Determinar a concentração celular presente na suspensão original: Concentração celular = Contagem total de células/4 x fator de diluição (10) x 10.000 = Células/mL
- Para calcular o rendimento celular (células por grama de tecido) obtido, multiplique a concentração celular pelo volume total da amostra original (em mL) e divida pelo peso do tecido digerido (em gramas).
- Avaliar a viabilidade celular quanto à porcentagem de células vivas da seguinte forma: % Viabilidade = (Número de células viáveis / Número total de células) x 100.
7. Caracterização de subpopulações de macrófagos a partir da fração vascular estromal
- Transferir um total de 1 x 106 células SVF/mL para um tubo de ensaio de polipropileno de fundo redondo de 5 mL para citometria de fluxo e células de pellet por centrifugação a 800 x g por 5 min a 4 °C.
- Vórtice cuidadosamente para soltar a pastilha e ressuspender as células em 100 μL de 1x PBS na RT.
- Adicionar concentração ótima pré-titulada de cada anticorpo monoclonal conjugado ao fluorocromo específico para um antígeno de superfície celular; misturar suavemente e incubar por 15 min no escuro em RT.
- Adicionar um excesso de PBS frio 1x (≈ 1 mL) e centrifugar o SVF a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte sobrenadantes rapidamente por decantação. Tenha cuidado para não perturbar o pellet.
- Adicionar 500 μL de solução lisante 1x e incubar 15 min em RT, protegendo os tubos da luz direta.
- Retire a solução após centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C e conservar a 2–8 °C no escuro até à aquisição dos dados.
- Vórtice as células completamente em baixa velocidade para reduzir a agregação antes de adquirir.
- Ressuspender o pastel de SVF em 5 mL de líquido de bainha na RT e, subsequentemente, filtrar através de três camadas de gaze em um novo tubo de ensaio de polipropileno de fundo redondo de 5 mL antes da análise por citometria de fluxo, para reduzir o entupimento das linhas de classificação celular.
- Vórtice cada tubo brevemente antes da análise.
- Adquira dados das amostras de interesse. Para análise de fluxo, conte um mínimo de 10.000 eventos.
NOTA: Se estiver usando um citômetro de fluxo de classificação celular, separe os macrófagos para aplicação em estudos subsequentes.
8. Estratégia de gating
- Plote a altura ou largura em relação à área para Forward Scatter (FSC) para determinar a população singlete (Figura 2A).
- Selecione as células plotando a área para Side Scatter (SSC) contra FSC, descartando os detritos celulares (Figura 2B).
- A partir de células selecionadas, identificar as populações que expressam CD45 como células hematopoéticas (Figura 2C) e células CD45/CD14 duplamente positivas como macrófagos (Figura 2D).
- A partir de macrófagos CD45+/CD14+, detectar células HLA-DR negativas e positivas (Figura 2E).
NOTA: Inclua os controles de compensação para o painel de anticorpos e ajuste a sobreposição espectral em um citômetro de fluxo multicolorido adequado para o painel. A análise por citometria de fluxo foi realizada utilizando-se um citômetro equipado com três lasers (laser violeta 405nm, laser azul 488nm e laser vermelho 640nm) e detectores para os fluorocromos indicados.
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Representative Results
Este protocolo descreve um método enzimático utilizando digestão de colagenase seguida de centrifugação diferencial para isolar, em um único processo, adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias de TAV obtidas de gestantes saudáveis após omentectomia parcial. Neste caso, utilizamos os adipócitos para extração de RNA e a FVA para fenotipagem de macrófagos.
O protocolo de extração de RNA permitiu a obtenção de RNA com pureza adequada, alta integridade e microRNAs de adipócitos maduros (Figura 1). A integridade do RNA avaliada por um analisador de controle de qualidade de RNA resultou em excelentes valores para as amostras de adipócitos isoladas com o protocolo (RIN = 9,7).
O total de células nucleadas presentes no VAT-SVF foi de aproximadamente 2,8 x 106 células/grama de TAV (2,8 x 106 ± 1,7 x 106), com viabilidade de 64% (63,9 ± 2,0) pelo teste de exclusão do azul de tripano. As células SVF foram marcadas com anticorpos primários conjugados a fluoróforos para identificar e caracterizar macrófagos AT por meio de análise de classificação celular ativada por fluorescência. A análise por citometria de fluxo gera gráficos mostrando diferentes populações celulares com base em marcadores celulares (Figura 2). Inicialmente, plotando-se a área de espalhamento frontal (FSC-A) vs altura de espalhamento frontal (FSC-H), os agregados celulares foram facilmente eliminados da análise (Figura 2A). Em seguida, os debris celulares foram excluídos por meio do agrupamento das células com base no tamanho e complexidade corretos, usando a área de espalhamento anterior (FSC-A) e a área de espalhamento lateral (SSC-A) (Figura 2B). Em seguida, para analisar os macrófagos, não foi necessário excluir outras células imunes. Primeiramente, células da linhagem monócitos/macrófagos foram selecionadas por meio de marcadores CD45 e CD14 (Figura 2C,D). Posteriormente, as células CD45/CD14 duplamente positivas foram separadas com base na expressão do marcador de macrófagos HLA-DR, onde foram identificados dois subgrupos de macrófagos: HLA-DR- e HLA-DR+ (Figura 2E).
Figura 1: Controle de qualidade do RNA de adipócitos maduros. (A) concentração de RNA, relação 260/280 e 260/230; (B) Análise de integridade. Eletroferograma, imagem em gel e número de integridade de RNA foram obtidos usando um analisador de controle de qualidade de RNA e um kit de analisador de RNA; (C) quantificação de microRNAs. Eletroferograma, imagem em gel e porcentagem de microRNA foram obtidos usando um analisador de controle de qualidade de RNA e um pequeno kit de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação de macrófagos do tecido adiposo visceral. Gráficos representativos de citometria de fluxo de macrófagos da fração vascular estromal isolados de tecido adiposo visceral coletados durante cesariana usando digestão com colagenase. (A) Identificação de singlets usando uma primeira porta de área de dispersão direta (FSC-A) vs altura de FSC (FSC-H) para remover duplos. (B) Uma segunda porta Forward Scatter-area (FSC-A) vs Side Scatter-area (SSC-A) foi usada para eliminar detritos com base no tamanho e densidade. (C,D) SSC-A vs porta CD45 identificou células de origem hematopoiética, e SSC-A vs porta CD14 identificou macrófagos. (E) Macrófagos CD45+/CD14+ totais foram acoplados com base no marcador HLA-DR e dois subgrupos de macrófagos foram identificados: HLA-DR- e HLA-DR+. Os gráficos ilustram dados representativos de indivíduos individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O IVA desempenha um papel crucial na regulação metabólica e inflamação. O crescente interesse no papel dos adipócitos e das células imunes na inflamação crônica associada à obesidade levou ao desenvolvimento de diferentes técnicas para separar a FVS das células adiposas presentes na TA. No entanto, a maioria das técnicas não permite obter esses dois diferentes conjuntos de células viáveis para aplicações a jusante a partir de uma mesma biópsia de TAV em um único procedimento, o que poderia ser crucial para estudos sobre interações entre adipócitos e células SVF. Portanto, implementamos este protocolo que fornece uma descrição detalhada para isolar adipócitos maduros viáveis e células SVF presentes em uma biópsia de TAV. Difere de relatos anteriores no tempo de digestão tecidual e concentração de colagenase, bem como tempo e velocidade de centrifugação para separação celular, permitindo rendimentos adequados de RNA de adipócitos e caracterização detalhada do subgrupo de macrófagos.
Uma grande quantidade de técnicas de isolamento enzimático e não enzimático para células derivadas do TA tem sido proposta, com diferentes efeitos sobre as características biológicas e propriedades funcionais das células isoladas 17,21,22,23,24, sendo necessário escolher a estratégia mais adequada de acordo com o objetivo perseguido. Frequentemente, adipócitos maduros e isolamento da FVS do tecido adiposo são obtidos usando enzimas de dissociação tecidual 25,26,27. Embora diferentes enzimas possam ser utilizadas para dissociar o TA, a digestão enzimática com colagenase permanece como padrão-ouro para digerir esse tecido27,28. Como o IVA é composto por uma matriz macia, pode ser facilmente digerido com colagenase tipo II. Esse procedimento evita a dissociação tecidual inadequada, pois essa enzima rompe o colágeno nativo da matriz extracelular, liberando muito mais células do estroma fibroso, com impacto desprezível na viabilidade celular, rendimento celular e expressão de diferenciação de agrupamentos19,27,28,29.
Em termos de digestão enzimática, também é essencial considerar a concentração enzimática, o período de digestão e os parâmetros de centrifugação para projetar um protocolo adequado para o isolamento de adipócitos maduros e SVF a partir do TAV, pois esses fatores podem afetar o fenótipo, a recuperação e a viabilidade celular na suspensão celularfinal 27,29. O uso da colagenase como enzima proteolítica é ideal em baixas concentrações [faixa de 0,075% a 0,3% (p/v)], com período de incubação inferior a 2 h, de modo que as características fenotípicas e funcionais da FVS, como taxa de proliferação, capacidade de diferenciação e frequência de linhagens celulares específicas, permanecem inalteradas30,31. Utilizamos um período máximo de digestão de 60 min e 0,25% de colagenase, reduzindo a concentração e o tempo de exposição à colagenase para obter um impacto desprezível na viabilidade celular e na expressão dos marcadores de superfície das células SVF, evitando resultados distorcidos na análise por citometria de fluxo. Também incluímos etapas suaves de centrifugação e tempos de centrifugação mais curtos, de 200 g/5 min, para melhorar a recuperação celular durante a separação das células de gordura, representando uma vantagem para o protocolo, uma vez que longos e intensos períodos de centrifugação [acima de 400 g/1 min] aumentam a morte dos adipócitos, limitando o rendimento celular 32,33,34. A recuperação celular da FVS obtida através do protocolo de digestão à base de colagenase é semelhante aos rendimentos típicos de 2–6 x 106 células/g TA relatados na literatura, enquanto a viabilidade da FVS de 63,9 ± 2,0 é moderadamente inferior ao limiar mínimo proposto de 70%–80% para esse tipo de célula 35,36,37,38. Isso provavelmente ocorre porque não utilizamos meios de cultura para ressuspender as células de SVF como protocolos padrão, uma vez que caracterizamos a população de macrófagos através de seus marcadores de superfície, e tem sido relatado que essas células exibem notável plasticidade em resposta às condições ambientais, mesmo alterando seu fenótipo 39,40,41.
Além disso, também é importante mencionar que as gestantes incluídas nesse protocolo como doadoras de TAV eram saudáveis, sem evidência clínica de comorbidades metabólicas, ganho de peso normal durante a gestação, idade média de 20 a 25 anos e Índice de Massa Corporal pré-gestacional normal (IMC 18,5 a 24,9 kg/m2; n = 7), pois alguns autores descreveram que diferentes doadores, idade, IMC e sexo ou etnia influenciam o número de células e a expressão de marcadores de superfície do SFV 42,43,44.
Por outro lado, a análise do perfil de expressão gênica requer quantidades razoáveis de RNA intacto, mas seu isolamento de adipócitos maduros é particularmente difícil, pois essas células têm maior conteúdo lipídico e, em alguns casos, o número de células é baixo45,46,47,48. Otimizamos um procedimento de isolamento de RNA de adipócitos maduros baseado em um método padrão de isotiocianato de guanidina/fenol49,50, implementando etapas fáceis que permitem eliminar lipídios e debris celulares. Após a preparação da amostra, a extração de RNA em coluna nos permite obter um RNA livre de DNA de alta qualidade, incluindo microRNAs, o que é bastante incomum para amostras de TA. A verificação da pureza e integridade desses RNAs por meio de um analisador de controle de qualidade de RNA baseado em microfluídica garante que a qualidade do RNA isolado seja apropriada para aplicações a jusante, como ensaios de RT-qPCR e microarrays de expressão.
Além das vantagens citadas anteriormente, a digestão do TA com colagenase permite liberar adipócitos e células imunes residentes simultaneamente, mantendo a integridade dos receptores de superfície celular; este é um fato importante durante o isolamento de células de FVS, para obter dados confiáveis e interpretáveis de citometria de fluxo27. Além disso, células isoladas de tecidos carregados de lipídios, como o TAV, tendem a ser mais propensas à agregação, reduzindo o rendimento celular classificado e aumentando a autofluorescência51. No protocolo, a eliminação desses agregados celulares por filtração através de três camadas de gaze antes da triagem e sua exclusão com a estratégia de gating descrita, minimizam a fluorescência de fundo, melhorando a qualidade da amostra para a triagem celular.
Estudos prévios foram realizados para identificar as células presentes na FVS utilizando um único conjunto de marcadores de CD característicos dessas células52,53,54,55,56,57,58,59. Para uma caracterização mais aprofundada dos subtipos de macrófagos em TAV SVF, categorizamos essas células pela expressão de marcadores específicos de superfície celular. De acordo com a expressão dos marcadores CD45 e CD14 utilizados para identificar células da linhagem monócitos/macrófagos em TAV60, verificamos que esse tecido é composto por uma população típica de macrófagos CD45+CD14+ de origem hematopoiética. Utilizando o mesmo protocolo, em estudo anterior foi possível caracterizar populações de macrófagos M1 (CD11c) e M2 (CD163 e CD206)20.
A fenotipagem de macrófagos dentro do TA tem sido categorizada como um espectro de macrófagos pró-inflamatórios (classicamente ativados-M1) a macrófagos anti-inflamatórios (alternativamente ativado-M2), de acordo com a presença de diferentes marcadores de ativação em suasuperfície61,62. O marcador de macrófagos HLA-DR reflete o grau de ativação macrofágica63,64 e foi incorporado ao protocolo para estabelecer o fenótipo M1 ou M2: populações de macrófagos expressando HLA-DR+ são inflamatórias e HLA-DR- representam macrófagos não inflamatórios. Assim, com base na expressão do marcador HLA-DR, foram definidos dois subgrupos de macrófagos: CD45+CD14+HLA-DR- e CD45+CD14+HLA-DR+, que se originam de monócitos circulantes e são mais conhecidos como macrófagos derivados de monócitos no tecido adiposo65,66.
Adicionalmente, quantificamos CD11c (marcador M1), bem como CD163 e CD206 (marcador M2) em cada subtipo de macrófagos, determinando que os macrófagos AT exibem todos os marcadores de ativação avaliados em sua superfície de membrana, demonstrando que os macrófagos presentes no TAV de gestantes têm características mais complexas do que as descritas para as classificações excessivamente simplificadas das populações de macrófagos M1 e M2. Assim, a aplicação da citometria de fluxo básica com painel de anticorpos multicoloridos e rigoroso acoplamento celular permite identificar e caracterizar os macrófagos do pool heterogêneo de células na FVS. A fenotipagem refinada de macrófagos obtida com o protocolo pode ser útil em estudos realizados para elucidar as mudanças dinâmicas de populações de macrófagos no TA que levam a distúrbios na homeostase do TA.
Embora esse protocolo tenha sido desenhado para caracterizar macrófagos de TAV, ajustes realizados no painel de anticorpos poderiam expandir suas aplicações para facilitar a triagem de outras células imunes residentes no TA, uma vez que numerosos anticorpos fluorescentes estão disponíveis para identificar marcadores específicos de diferentes linhagens. Além disso, o método permite que populações celulares purificadas por triagem celular possam ser usadas para análises pós-classificação, como extração de DNA/RNA/proteína ou tratamentos ex vivo , obtendo as células diretamente em um meio apropriado com técnicas de esterilidade.
Em resumo, consideramos que o protocolo aqui detalhado representa o tradeoff mais eficiente entre tempo, recursos, rendimento celular e viabilidade celular, além de ser altamente eficiente para extração de RNA e miRNA de células adiposas e para caracterização da população de macrófagos em TA.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Perinatologia (números do processo: 3300-11402-01-575-17 e 212250-3210-21002-06-15) e CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (processo número 2015-3-2-61661).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | - |
| 2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
| 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
| Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | - |
| Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | - |
| APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
| Baker | - | - | 250 ml, non sterile |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
| Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | - |
| Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
| Dissecting forceps | - | - | Steel, serrated jaws and round ends |
| Dissection tray | - | - | Stainless steel |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | - |
| FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | - |
| FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | - |
| FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | - |
| Manual cell counter | - | - | - |
| Mayo dissecting scisors | - | - | Stainless steel |
| Microcentrifuge | - | - | Adjustable temperature |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | - |
| Orbital shaker | - | - | Adjustable temperature and speed |
| P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
| P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
| P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
| P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
| PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | - |
| PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
| PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Pipette controller | - | - | - |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
| Refrigerated centrifuge | - | - | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
| Sterile Specimen container | - | - | - |
| Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
| Tube racks | - | - | For different tube sizes |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | - |
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