Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Isolering av livskraftiga adipocyter och stromal vaskulär fraktion från human visceral fettvävnad lämplig för RNA-analys och makrofagfenotypning

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61884
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 2, 7, 8
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

Summary

Detta protokoll ger en effektiv kollagenasnedbrytningsmetod för isolering av livskraftiga adipocyter och stromala vaskulära fraktions-SVF-celler från humant visceralt fett i en enda process, inklusive metodik för att erhålla högkvalitativt RNA från adipocyter och fenotypifiering av SVF-makrofager genom färgning av flera membranbundna markörer för analys med flödescytometri.

Abstract

Visceral fettvävnad (VAT) är ett aktivt metaboliskt organ som huvudsakligen består av mogna adipocyter och stromala vaskulära fraktionsceller (SVF), som frisätter olika bioaktiva molekyler som styr metaboliska, hormonella och immunprocesser; För närvarande är det oklart hur dessa processer regleras i fettväven. Därför är utvecklingen av metoder som utvärderar varje cellpopulations bidrag till fettvävnadens patofysiologi avgörande. Detta protokoll beskriver isoleringsstegen och ger nödvändiga felsökningsriktlinjer för effektiv isolering av livskraftiga mogna adipocyter och SVF från humana momsbiopsier i en enda process, med hjälp av en kollagenasenzymatisk matsmältningsteknik. Dessutom är protokollet också optimerat för att identifiera makrofagundergrupper och utföra mogen adipocyt-RNA-isolering för genuttrycksstudier, vilket gör det möjligt att utföra studier som dissekerar interaktionen mellan dessa cellpopulationer. Kortfattat tvättas momsbiopsier, mals mekaniskt och smälts för att generera en encellssuspension. Efter centrifugering isoleras mogna adipocyter genom flotation från SVF-pelleten. RNA-extraktionsprotokollet säkerställer ett högt utbyte av totalt RNA (inklusive miRNA) från adipocyter för nedströms uttrycksanalyser. Samtidigt används SVF-celler för att karakterisera makrofagundergrupper (pro- och antiinflammatorisk fenotyp) genom flödescytometrianalys.

Introduction

Vit fettvävnad består inte bara av fettceller eller adipocyter, utan också av en icke-fettcellsfraktion som kallas stromal vaskulär fraktion (SVF), som innehåller en heterogen cellpopulation bestående av makrofager, andra immunceller som regulatoriska T-celler (Tregs) och eosinofiler, preadipocyter och fibroblaster, omgivna av kärl- och bindväv 1,2. Fettvävnad (AT) anses nu vara ett organ som reglerar fysiologiska processer relaterade till metabolism och inflammation genom adipokiner, cytokiner och mikroRNA som produceras och frisätts av olika celler i vävnaden, med autokrina, parakrina och endokrina effekter 3,4. Hos människor omfattar vit fettvävnad den subkutana fettvävnaden (SAT) och den viscerala fettvävnaden (VAT), med viktiga anatomiska, molekylära, cellulära och fysiologiska skillnader mellan dem 2,5. SAT representerar upp till 80 % av humant AT, medan moms ligger i bukhålan, främst i tarmkäxet och omentum, och är metabolisktmer aktiv. Dessutom är moms ett endokrint organ som utsöndrar mediatorer med en betydande inverkan på kroppsvikt, insulinkänslighet, lipidmetabolism och inflammation. Följaktligen leder momsackumulering till bukfetma och fetmarelaterade sjukdomar som typ 2-diabetes, metabolt syndrom, högt blodtryck och risk för hjärt- och kärlsjukdomar, vilket representerar en bättre prediktor för fetmarelaterad dödlighet 6,7,8,9.

Vid homeostatiska förhållanden samarbetar fettceller, makrofager och de andra immuncellerna för att upprätthålla momsmetabolismen genom utsöndring av antiinflammatoriska mediatorer10. En alltför stor momsexpansion främjar dock rekryteringen av aktiverade T-celler, NK-celler och makrofager. Faktum är att i mager moms är förhållandet mellan makrofagerna 5 %, medan detta förhållande stiger upp till 50 % vid fetma, med makrofagpolarisering från antiinflammatorisk till proinflammatorisk fenotyp, vilket genererar en kronisk inflammatorisk miljö10,11.

Som en konsekvens av fetmapandemin har ett häpnadsväckande antal rapporter uppstått som behandlar olika forskningsämnen, inklusive adipocytbiologi, epigenetik, inflammation, endokrina egenskaper och framväxande områden som extracellulära vesiklar, bland annat 8,10,12,13. Men även om momsmiljön definieras av överhörning mellan adipocyter och de bofasta eller anländande makrofagerna, har de flesta studier fokuserat på endast en cellpopulation, och det finns lite information om interaktionen mellan dessa celler i moms och deras patofysiologiska konsekvenser11,14. Dessutom utfördes värdefulla studier som behandlade samspelet mellan adipocyter och makrofager i AT med hjälp av cellinjer, som saknade in vivo-primingförhållandena 11,14,15. En lämplig strategi för att dissekera dessa cellers interaktion eller särskilda bidrag till mervärdesskatt kräver isolering av båda celltyperna från samma fettbiopsi för att utföra in vitro-analyser som så lika som möjligt återspeglar de in vivo-egenskaper som reglerar momsmetabolismen.

Även om de icke-enzymatiska dissociationsmetoderna baserade på mekaniska krafter för att bryta AT säkerställer minimal manipulation, kan dessa metoder inte användas om syftet är att studera SVF-celler, eftersom de har lägre effektivitet i cellåterhämtning och låg cellviabilitet jämfört med enzymatiska metoder, och en större vävnadsvolym behövs16,17. Enzymatisk nedbrytning med kollagenas är en skonsam metod som möjliggör adekvat nedbrytning av kollagen och extracellulära matrisproteiner i fibrösa vävnader såsom WAT18 och används ofta när trypsin är ineffektivt eller skadligt19. Protokollet ger grundläggande felsökningsriktlinjer för effektiv isolering av livskraftiga mogna adipocyter och SVF-celler från humana momsbiopsier i en enda process, med hjälp av en kollagenasenzymatisk nedbrytningsteknik, vilket ger information för att säkerställa höga utbyten (kvantitet, renhet och integritet) av totalt RNA från mogna adipocyter, inklusive mikroRNA, för nedströms uttrycksapplikationer. Samtidigt optimeras protokollet för att identifiera makrofagundergrupper från SVF-celler genom färgning av flera membranbundna markörer för vidare analys med flödescytometri20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll har godkänts av IRB vid Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Deltagandet var frivilligt och alla inskrivna kvinnor undertecknade formuläret för informerat samtycke.

1. Insamling av visceral fettvävnad

  1. Erhålla momsbiopsier genom partiell omentektomi under kejsarsnitt från friska vuxna kvinnor med singelgraviditeter utan förlossning.
  2. Efter livmoderstängning och hemostas, fortsätt med att identifiera större omentum och förläng det på en våt kompress. Den exponerade momsen är moms.
  3. Lokalisera det största blodkärlet och spåra en imaginär linje på 7 x 5 cm till den större omentumbasen.
  4. Identifiera en avaskulär zon och använd Kelly-pincett för att borra den yttre sidan av momsen.
  5. Använd Ochsner-pincett för att klämma fast den proximala och distala sidan i zonen där moms borrades och använd Metzenbaum-sax för att klippa vävnaden.
  6. Knyt ihop den större buken med svart siden nummer 1.
  7. Ta bort Ochsner-pincetten och utvärdera hemostasen.
  8. Lägg momsbiopsin i en steril behållare och transportera den omedelbart till laboratoriet.

2. Enzymatisk nedbrytning av visceral fettvävnad och isolering av mogna adipocyter och stromala vaskulära fraktionsceller

  1. Väg momsbiopsin och skölj med 1x PBS pH 7,4.
  2. Klipp 4 g moms och använd en sax för att mala vävnaden i små bitar i en dissektionsbricka.
  3. Överför mald moms till ett sterilt 50 ml centrifugrör, tillsätt 20 ml PBS och skaka försiktigt för att ta bort överskottet av röda blodkroppar.
  4. Kassera PBS och upprepa proceduren två gånger.
  5. Överför momsen till ett nytt sterilt 50 ml centrifugrör och tillsätt 25 ml digestionslösning (0,25 % kollagenas typ II, 5 mM glukos, 1,5 % albumin i PBS).
  6. Inkubera vid 37 °C i 60 minuter i en orbital shaker vid 125 varv per minut.
  7. Filtrera den upplösta vävnaden genom tre lager gasväv till ett nytt sterilt 50 ml centrifugrör.
  8. Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C.
  9. Två faser erhålls, en övre fas som motsvarar mogna adipocyter, medan SFV-celler stannar kvar i pelleten. Överför försiktigt de mogna adipocyterna till ett nytt sterilt 50 ml centrifugrör med hjälp av en överföringspipett.
  10. Tillsätt 20 ml kall PBS, skaka försiktigt och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid 4 °C.
  11. Kassera PBS och upprepa proceduren två gånger.
  12. Använd en överföringspipett för att försiktigt överföra de mogna adipocyterna till ett 1.5 ml DNase-RNase-fritt mikrocentrifugrör.
  13. Centrifugera vid 200 x g i 1 minut vid 4 °C och ta bort överflödig PBS med en P200-mikropipett. Upprepa detta steg om det behövs.
  14. Överför försiktigt 300 μL mogen adipocytsuspension till ett 1,5 ml DNase-RNasfritt mikrocentrifugrör. Förvara mogna adipocyter vid -80 °C tills RNA extraheras.
    OBS: Adipocyter bildar inte en pellet.
  15. När fettcellerna har separerats (steg 2.9), aspirera det mesta av uppslutningslösningen med en överföringspipett och behåll SVF-pelleten i botten av röret.
  16. Överför pelleten med SVF-celler till ett nytt 50 ml centrifugrör med hjälp av en överföringspipett.
  17. Tvätta cellpelleten försiktigt, suspendera i 20 ml kall 1x PBS genom att pipettera upp och ner.
  18. Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten snabbt genom dekantering.
  19. Utför en andra tvätt genom att upprepa steg 2.17 och 2.18.
  20. Tillsätt 5 ml lysbuffert för röda blodkroppar i jämvikt med rumstemperatur (RT) till SVF-pelleten och suspendera genom upprepad pipettering. Virvla inte.
  21. Inkubera i 5 minuter vid RT och centrifugera i 5 minuter vid 800 x g. Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en överföringspipett och kassera den på rätt sätt.
  22. För att neutralisera lyseringsbufferten, tillsätt 10 ml kall 1x PBS och blanda försiktigt tills cellpelleten sönderdelas.
  23. Centrifugera vid 800 x g i 5 minuter för att få SVF-pellets och kassera PBS. En vit pellet ska vara synlig i botten av röret.
  24. Återsuspendera celler i 5 ml 1x PBS vid RT genom upprepad pipettering och filtrera genom tre lager gasväv till ett nytt 50 ml koniskt rör. Därefter kommer dessa celler att användas för karakterisering av makrofagsubpopulationer genom flödescytometri.

3. RNA-extraktion från mogna adipocyter

  1. Förbered ett rent område med RNase-dekontamineringsspray för att undvika RNA-nedbrytning. Använd en uppsättning pipetter som är reserverade för RNA-procedurer. Alla rör och spetsar som används ska vara RNase-fria.
  2. Tina den mogna adipocytsuspensionen (avsnitt 2.14) vid 4 °C om den förvarats till -80 °C.
    OBS: Undvik flera frys-upptiningscykler.
  3. Lysera cellerna genom att tillsätta 1 000 μl syra-guanidinium-fenolbaserat reagens och blanda noggrant med en P1000-mikropipett för att homogenisera.
  4. Inkubera i 5 minuter vid RT för att öka dissociationen av nukleoproteinkomplex.
  5. Centrifugera celllysatet i 5 minuter vid 12 000 x g vid RT. Tre faser kommer att erhållas: en övre fas (gul) som motsvarar fettcellslipider, en mellanfas (rosa) som motsvarar nukleinsyror och en pellet (cellulärt skräp).
  6. Ta försiktigt bort lipidskiktet med hjälp av en P200-mikropipett.
  7. Överför mellanfasen till ett nytt 2 ml rör, undvik lipidrester och pellets som stör (cirka 700 μL).

4. Rening av totalt RNA, inklusive mikroRNA

OBS: En kolonnbaserad total RNA-reningsmetod används för att erhålla totalt RNA av hög kvalitet.

  1. Tillsätt en lika stor volym etanol (95–100 %) till provet från punkt 3.7, ca 700 μL, och blanda för hand och vänd röret i 10 s.
  2. Överför 700 μl av blandningen till en kolonn som sätts in i ett uppsamlingsrör, centrifugera och kassera genomströmningen.
  3. Ladda om kolumnen och upprepa steg 4.2.
  4. Överför kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör.
  5. Tillsätt 400 μl förtvättsbuffert till kolonnen och centrifugera. Kassera genomströmningen och upprepa detta steg.
  6. Tillsätt 700 μl tvättbuffert till kolonnen och centrifugera i 2 minuter.
  7. Överför kolonnen försiktigt till ett nukleasfritt rör.
  8. Tillsätt 50 μl nukleasfritt vatten direkt till kolonnmatrisen och eluera RNA genom centrifugering. Bered alikvoter på 10 μl med hjälp av 200 μL mikrofugerör.
  9. Lägg omedelbart alikvoter på is och använd en av dem för att bestämma RNA-koncentration och renhet.
  10. Bered en alikvot på 5 μl totalt RNA justerat till 100 ng/μl för att mäta RNA-integritet och mikroRNA-koncentration.
  11. Förvaras vid -80 °C fram till användning.

5. Bestämning av mogen adipocyt-RNA-koncentration, renhet och integritet; Analys av mikroRNA-kvantifiering

OBS: RNA-koncentration och renhetsbestämningar utförs med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer; RNA-integritet och miRNA-kvantifiering utförs med hjälp av en RNA-kvalitetskontrollanalysator.

  1. Tvätta provläsaren med vatten av molekylär kvalitet och torka av.
  2. Ladda 2 μL elueringsvatten (blankt), ändra inställningen till RNA och klicka på knappen Tom .
  3. Ladda 2 μL sample och klicka på knappen Mät .
  4. När avläsningen är klar, registrera A260/A280- och A260/A230-förhållandena samt mängden RNA (ng/μL) (figur 1A).
    OBS: RNA med OD260/OD280 och OD260/OD230-förhållande runt 2,0 anses vara rent.
  5. Mät RNA-integritetsnumret (RIN) med hjälp av ett RNA-integritetskit enligt tillverkarens instruktioner (figur 1B).
    OBS: Ett RIN = 10 motsvarar intakt RNA, medan ett RIN ≤ 3.0 indikerar ett starkt nedbrutet RNA. För expressionsmikroarrayer eller RT-qPCR, använd RNA med RIN ≥ 6.0.
  6. Använd ett litet RNA-kit för att bestämma koncentrationen och procentandelen mikroRNA, enligt tillverkarens instruktioner (Figur 1C).
    OBS: För att undvika överskattning av små och mikro-RNA, använd RNA-prover med RIN ≥ 6.0.

6. Antal och viabilitet av stromala vaskulära fraktionsceller

  1. Späd 10 μl SVF-cellsuspension (avsnitt 2.24) till 90 μl 0,4 % trypanblå lösning (slutlig spädning 1:10) och applicera 10 μl på en standardhemocytometer.
  2. Räkna de livsdugliga cellerna noggrant, med undantag för de döda cellerna, i fyra rutor i hörnet av räknekammaren.
  3. Bestäm cellkoncentrationen i den ursprungliga suspensionen: Cellkoncentration = totalt cellantal/4 x utspädningsfaktor (10) x 10 000 = celler/ml
  4. För att beräkna det erhållna cellutbytet (celler per gram vävnad) multipliceras den cellulära koncentrationen med den ursprungliga totala provvolymen (i ml) och divideras med vikten av den smälta vävnaden (i gram).
  5. Beräkna cellviabiliteten som procentandelen levande celler enligt följande: % viabilitet = (antal livsdugliga celler / totalt antal celler) x 100.

7. Karakterisering av makrofagundergrupper från stromal vaskulär fraktion

  1. Överför totalt 1 x 106 SVF-celler/ml till ett 5 ml rundbottnat polypropenprovrör för flödescytometri och pelletsceller genom centrifugering vid 800 x g i 5 minuter vid 4 °C.
  2. Virvla försiktigt för att lossa pelleten och återsuspendera cellerna i 100 μL 1x PBS vid RT.
  3. Tillsätt en i förväg titrerad optimal koncentration av varje fluorokromkonjugerad monoklonal antikropp som är specifik för ett cellyteantigen. Blanda försiktigt och inkubera i 15 min i mörker vid RT.
  4. Tillsätt ett överskott av kallt 1 x PBS (≈ 1 ml) och centrifugera SVF vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
  5. Kassera supernatanter snabbt genom dekantering. Var försiktig så att du inte stör pelleten.
  6. Tillsätt 500 μL 1x lyseringslösning och inkubera 15 minuter vid RT, skydda rören från direkt ljus.
  7. Avlägsna lösningen efter centrifugering vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C och förvara vid 2–8 °C i mörker tills data samlas in.
  8. Virvla cellerna noggrant vid låg hastighet för att minska aggregeringen innan du förvärvar.
  9. Återsuspendera SVF-pelleten i 5 ml mantelvätska vid RT och filtrera sedan genom tre lager gasväv till ett nytt 5 ml polypropenprovrör med rund botten före analys med flödescytometri, för att minska igensättning av cellsorterarlinjerna.
  10. Virvla varje rör kort före analys.
  11. Hämta data från de prover som är av intresse. För flödesanalys räknar du minst 10 000 händelser.
    OBS: Om du använder en cellsorteringsflödescytometer, separera makrofagerna för applicering i efterföljande studier.

8. Strategi för grind

  1. Plotta höjden eller bredden mot området för Forward Scatter (FSC) för att bestämma singlettpopulationen (figur 2A).
  2. Markera celler som plottar området för Side Scatter (SSC) mot FSC och kassera det cellulära skräpet (figur 2B).
  3. Från utvalda celler identifieras de populationer som uttrycker CD45 som hematopoetiska celler (Figur 2C) och CD45/CD14 dubbelpositiva celler som makrofager (Figur 2D).
  4. Från CD45+/CD14+ makrofager, detektera negativa och positiva HLA-DR-celler (figur 2E).
    OBS: Inkludera kompensationskontrollerna för antikroppspanelen och justera spektralöverlappningen på en flerfärgad flödescytometer som är lämplig för panelen. Vi utför flödescytometrianalys med hjälp av en cytometer utrustad med tre lasrar (405 nm violett laser, 488 nm blå laser och 640 nm röd laser) och detektorer för de angivna fluorokromerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver en enzymatisk metod som använder kollagenasnedbrytning följt av differentiell centrifugering för att i en enda process isolera livsdugliga mogna adipocyter och SVF-celler från momsbiopsier erhållna från friska gravida kvinnor efter partiell omentektomi. I det här fallet använder vi adipocyterna för RNA-extraktion och SVF för makrofagfenotypning.

RNA-extraktionsprotokollet gjorde det möjligt att erhålla RNA med tillräcklig renhet, hög integritet och mikroRNA från mogna adipocyter (figur 1). RNA-integriteten bedömd av en RNA-kvalitetskontrollanalysator resulterade i utmärkta värden för proverna av adipocyter isolerade med protokollet (RIN = 9,7).

Det totala antalet kärnförsedda celler som fanns i VAT-SVF var cirka 2,8 x 106 celler/gram moms (2,8 x 106 ± 1,7 x 106), med 64 % viabilitet (63,9 ± 2,0) med hjälp av trypanblå uteslutningstestet. SVF-celler märktes med fluoroforkonjugerade primära antikroppar för att identifiera och karakterisera AT-makrofager genom fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys. Flödescytometrianalys genererar diagram som visar olika cellpopulationer baserat på cellulära markörer (Figur 2). Till en början, genom att plotta Forward Scatter-area (FSC-A) vs Forward Scatter-height (FSC-H), kunde cellaggregat enkelt elimineras från analysen (Figur 2A). Därefter uteslöts cellulärt skräp genom att styra cellerna baserat på korrekt storlek och komplexitet med hjälp av Forward Scatter-area (FSC-A) och Side Scatter-area (SSC-A) (Figur 2B). För att analysera makrofager var det inte nödvändigt att utesluta andra immunceller. Först selekterades monocyt-/makrofaglinjeceller med hjälp av CD45- och CD14-markörer (Figur 2C,D). Därefter separerades de dubbla positiva CD45/CD14-cellerna baserat på makrofagmarkörens HLA-DR-uttryck, där två undergrupper av makrofager identifierades: HLA-DR- och HLA-DR+ (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: RNA-kvalitetskontroll från mogna fettceller. A) RNA-koncentration, förhållandet 260/280 och 260/230. (B) Analys av integritet. Elektroferogram, gelbild och RNA-integritetsnummer erhölls med hjälp av en RNA-kvalitetskontrollanalysator och ett RNA-analysatorkit; (C) Kvantifiering av mikroRNA. Elektroferogram, gelbild och mikroRNA-procent erhölls med hjälp av en RNA-kvalitetskontrollanalysator och ett litet RNA-kit. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Identifiering av makrofager från visceral fettvävnad. Representativa flödescytometridiagram av stromala vaskulära fraktionsmakrofager isolerade från visceral fettvävnad som samlats in under ett kejsarsnitt med kollagenasnedbrytning. (A) Identifiering av singlets med hjälp av en grind med hjälp av en grind med FSC-A (Forward Scatter-area) och FSC-höjd (FSC-H) för att ta bort dubbletter. (B) En andra grind med Forward Scatter-area (FSC-A) jämfört med Side Scatter-area (SSC-A) användes för att eliminera skräp baserat på storlek och densitet. (C,D) SSC-A vs CD45 gate identifierade celler från hematopoetiskt ursprung, och SSC-A vs CD14 gate identifierade makrofager. (E) Totalt antal CD45+/CD14+-makrofager reglerades baserat på HLA-DR-markör och två undergrupper av makrofager identifierades: HLA-DR- och HLA-DR+. Diagrammen illustrerar representativa data från enskilda ämnen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Moms spelar en avgörande roll i metabolisk reglering och inflammation. Ett ökat intresse för fettcellernas och immuncellernas roll i den kroniska inflammation som är förknippad med fetma har lett till utvecklingen av olika tekniker för att separera SVF och fettceller som finns i AT. De flesta tekniker gör det dock inte möjligt att erhålla dessa två olika uppsättningar av celler som är livskraftiga för nedströmstillämpningar från samma momsbiopsi i en enda procedur, vilket kan vara avgörande för studier av interaktioner mellan adipocyter och SVF-celler. Därför implementerade vi detta protokoll som ger en detaljerad beskrivning för att isolera livskraftiga mogna adipocyter och SVF-celler som finns i en momsbiopsi. Den skiljer sig från tidigare rapporter när det gäller tidpunkten för vävnadsnedbrytning och kollagenaskoncentration, samt tid och hastighet för centrifugering för cellseparation, vilket möjliggör adekvata adipocyt-RNA-utbyten och detaljerad karakterisering av makrofagundergrupper.

En stor mängd enzymatiska och icke-enzymatiska isoleringstekniker för AT-härledda celler har föreslagits, med olika effekter på de biologiska egenskaperna och funktionella egenskaperna hos isolerade celler 17,21,22,23,24, så det är nödvändigt att välja den lämpligaste strategin enligt det eftersträvade målet. Ofta uppnås mogna adipocyter och SVF-isolering från fettvävnad med hjälp av vävnadsdissociationsenzymer 25,26,27. Även om olika enzymer kan användas för att dissociera AT, kvarstår den enzymatiska nedbrytningen med kollagenas som guldstandarden för att smälta denna vävnad27,28. Eftersom moms består av en mjuk matris kan den lätt smältas med kollagenas typ II. Denna procedur undviker felaktig vävnadsdissociation eftersom detta enzym stör den extracellulära matrisens ursprungliga kollagen och frigör många fler celler från det fibrösa stromat, med en försumbar inverkan på cellviabilitet, cellutbyte och klusterdifferentieringsuttryck 19,27,28,29.

När det gäller enzymatisk nedbrytning är det också viktigt att ta hänsyn till enzymkoncentrationen, nedbrytningsperioden samt centrifugeringsparametrarna för att utforma ett lämpligt protokoll för isolering av mogna adipocyter och SVF-celler från moms eftersom dessa faktorer kan påverka cellfenotyp, återhämtning och viabilitet i den slutliga cellsuspensionen27,29. Användningen av kollagenas som ett proteolytiskt enzym är idealisk vid låg koncentration [intervall 0,075 % till 0,3 % (vikt/volym)], med en inkubationstid på mindre än 2 timmar, så de fenotypiska och funktionella SVF-egenskaperna såsom spridningshastighet, differentieringskapacitet och frekvens av specifika cellulära linjer, förblir oförändrade30,31. Vi använder en maximal matsmältningsperiod på 60 minuter och 0,25 % kollagenas, vilket minskar koncentrationen och längden på kollagenasexponeringen för att få en försumbar inverkan på cellulär viabilitet och SVF-cellers ytmarköruttryck, vilket undviker skeva resultat i flödescytometrianalysen. Vi inkluderar också skonsamma centrifugeringssteg och kortare centrifugeringstider på 200 g/5 min för att förbättra cellåterhämtningen under fettcellsseparation, vilket representerar en fördel för protokollet, eftersom långa och intensiva centrifugeringsperioder [över 400 g/1 min] ökar adipocyternas död, vilket begränsar cellutbytet 32,33,34. Den SVF-cellulära återhämtningen som uppnås genom det kollagenasbaserade matsmältningsprotokollet liknar de typiska utbytena på 2–6 x 106 celler/g AT som rapporterats i litteraturen, medan SVF-viabiliteten på 63,9 ± 2,0 är måttligt lägre än det lägsta föreslagna tröskelvärdet på 70 %–80 % för dessa typer av celler 35,36,37,38. Detta beror sannolikt på att vi inte använder odlingsmedia för att återsuspendera SVF-cellerna som standardprotokoll, eftersom vi karakteriserar makrofagpopulationen genom deras ytmarkörer, och det har rapporterats att dessa celler uppvisar anmärkningsvärd plasticitet som svar på miljöförhållanden, till och med ändrar deras fenotyp 39,40,41.

Dessutom är det också viktigt att nämna att de gravida kvinnor som ingår i detta protokoll som momsdonatorer var friska, utan kliniska tecken på metabola komorbiditeter, normal viktökning under graviditeten, medelålder 20–25 år och normalt pregestationellt Body Mass Index (BMI 18,5–24,9 kg/m2; n = 7), eftersom vissa författare har beskrivit att olika donatorer, ålder, BMI och kön eller etnicitet har en inverkan på cellantalet och uttrycket av SFV-ytmarkörer 42,43,44.

Å andra sidan kräver analys av genuttrycksprofiler rimliga mängder intakt RNA, men dess isolering från mogna adipocyter är särskilt svår eftersom dessa celler har ett högre lipidinnehåll och i vissa fall är cellantalet lågt 45,46,47,48. Vi optimerade en RNA-isoleringsprocedur från mogna adipocyter baserat på en standardmetod för guanidinisotiocyanat/fenol49,50, och implementerade enkla steg som gör det möjligt att eliminera lipider och cellulärt skräp. Efter provberedning gör kolonnbaserad RNA-extraktion det möjligt för oss att få ett DNA-fritt RNA av hög kvalitet, inklusive mikroRNA, vilket är ganska ovanligt för AT-prover. Renhets- och integritetsverifieringen av dessa RNA genom en mikrofluidikbaserad RNA-kvalitetskontrollanalysator säkerställer att isolerad RNA-kvalitet är lämplig för nedströmsapplikationer såsom RT-qPCR-analyser och expressionsmikroarrayer.

Förutom de fördelar som nämnts tidigare, tillåter AT-matsmältning med kollagenas att frigöra adipocyter och bosatta immunceller samtidigt, vilket upprätthåller integriteten hos cellytereceptorer; Detta är ett viktigt faktum under SVF-cellisolering för att få tillförlitliga och tolkningsbara flödescytometridata27. Dessutom tenderar celler isolerade från lipidladdade vävnader som moms att vara mer benägna att aggregera, vilket minskar det sorterade cellutbytet och ökar autofluorescensen51. I protokollet minimeras bakgrundsfluorescensen genom eliminering av dessa cellaggregat genom filtrering genom tre lager gasväv före sortering och deras uteslutning med den beskrivna gating-strategin, vilket förbättrar provkvaliteten för cellsortering.

Tidigare studier har genomförts för att identifiera de celler som finns i SVF med hjälp av en enda uppsättning CD-markörer som är karakteristiska för dessa celler 52,53,54,55,56,57,58,59. För en mer djupgående karakterisering av makrofagsubtyper i moms-SVF kategoriserade vi dessa celler efter uttryck av specifika cellytemarkörer. Enligt CD45- och CD14-marköruttryck som används för att identifiera monocyt-/makrofaglinjeceller i VAT60, fann vi att denna vävnad består av en typisk CD45+CD14+ makrofagpopulation av hematopoetiskt ursprung. Med hjälp av samma protokoll kunde vi i en tidigare studie karakterisera makrofagpopulationerna M1 (CD11c) och M2 (CD163 och CD206)20.

Makrofagfenotypningen inom AT har kategoriserats som ett spektrum från proinflammatoriska makrofager (klassiskt aktiverade-M1) till antiinflammatoriska makrofager (alternativt aktiverade-M2) beroende på närvaron av olika aktiveringsmarkörer på dess yta 61,62. HLA-DR-makrofagmarkören återspeglar makrofagaktiveringsgraden63,64 och införlivades i protokollet för att fastställa M1- eller M2-fenotypen: makrofagpopulationer som uttrycker HLA-DR+ är inflammatoriska och HLA-DR- representerar icke-inflammatoriska makrofager. Så, baserat på HLA-DR-marköruttryck, definierades två undergrupper av makrofager: CD45+CD14+HLA-DR- och CD45+CD14+HLA-DR+, som härstammar från cirkulerande monocyter och mer kända som monocythärledda makrofager i fettvävnaden65,66.

Dessutom kvantifierade vi CD11c (M1-markör), såväl som CD163 och CD206 (M2-markör) på varje makrofagsubtyp, och fastställde att AT-makrofager visar alla utvärderade aktiveringsmarkörer på sin membranyta, vilket visar att makrofager som finns i moms från gravida kvinnor har mer komplexa egenskaper än de som beskrivs för de alltför förenklade klassificeringarna av M1- och M2-makrofagpopulationer. Så, genom att tillämpa grundläggande flödescytometri med flerfärgad antikroppspanel och sträng cellreglering blir det möjligt att identifiera och karakterisera makrofagerna från den heterogena poolen av celler i SVF. Den förfinade makrofagfenotypningen som erhålls med protokollet kan vara användbar i studier som utförs för att belysa de dynamiska förändringarna av makrofagpopulationer i AT som leder till störningar i AT-homeostasen.

Även om detta protokoll utformades för att karakterisera momsmakrofager, kan justeringar som görs i antikroppspanelen utöka dess tillämpningar för att underlätta sortering av andra immunceller som finns i AT, eftersom många fluorescerande antikroppar finns tillgängliga för att identifiera specifika markörer av olika härstamning. Dessutom gör metoden det möjligt att använda cellpopulationer som renats genom cellsortering för eftersorteringsanalyser som DNA/RNA/proteinextraktion eller ex vivo-behandlingar , där cellerna erhålls direkt i ett lämpligt medium med sterilitetstekniker.

Sammanfattningsvis anser vi att protokollet som beskrivs här representerar den mest effektiva avvägningen mellan tid, resurser, cellulärt utbyte och cellviabilitet, förutom att det är mycket effektivt för RNA- och miRNA-extraktion från fettceller och för karakterisering av makrofagpopulationen i AT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Denna studie finansierades av Instituto Nacional de Perinatologia (bidragsnummer: 3300-11402-01-575-17 och 212250-3210-21002-06-15) och CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (anslagsnummer 2015-3-2-61661).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes Corning CLS4101-50EA Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip Axygen T-300-L-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip Axygen T-300-R-S RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip Axygen T-1000-B-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-200-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip Axygen T-200-Y-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA -
2101 Bioanalyzer PC Agilent G2953CA 2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube Corning 352003  Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes Corning CLS430828-100EA Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent Zymo Research R2050-1-200 TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 -
Agilent Small RNA Kit Agilent 5067-1548 -
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody BioLegend 325620 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker - - 250 ml, non sterile
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3912-100G Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station Agilent 5065-9951 -
Collagenase type II Gibco 17101-015 Powder
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G Powder
Direct-zol RNA Miniprep Zymo Research R2051 Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps - - Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray - - Stainless steel
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023-500ML 200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid BD Biosciences 342003 -
FACS Lysing Solution BD Biosciences 349202 -
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter BD Biosciences 648282 -
FASCDiva Software BD Biosciences 642868 Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer Sigma Z359629-1EA -
Manual cell counter - - -
Mayo dissecting scisors - - Stainless steel
Microcentrifuge - - Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific ND2000LAPTOP -
Orbital shaker - - Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642040 1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642090 100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642010 0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642080 20 to 200 μL
PCR tube storage rack Axygen R96PCRFSP -
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307608 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody BioLegend 304016 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P3813-10PAK Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller - - -
Red Blood Cells Lysis Buffer Roche 11 814 389 001 For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge - - Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container - - -
Transfer pipette Thermo Scientific-Samco 204-1S Sterile
Trypan Blue Gibco 15250-061 0.4% Solution
Tube racks - - For different tube sizes
Vortex Mini Shaker Cientifica SENNA BV101 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
  4. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  5. Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
  6. Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
  7. West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
  8. Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
  9. Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403 (2017).
  10. Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
  11. Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613 (2015).
  12. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), Lausanne. 202 (2017).
  13. Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
  14. Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
  15. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  16. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
  17. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88 (2019).
  18. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
  19. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
  20. Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074 (2018).
  21. Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
  22. Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), London, England. 1-14 (2015).
  23. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  24. Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457 (2019).
  25. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282 (2019).
  26. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
  27. Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321 (2015).
  28. Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells' isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54 (2014).
  29. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  30. Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610 (2012).
  31. Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59 (2011).
  32. Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
  33. Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
  34. Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
  35. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  36. Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
  37. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
  38. Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
  39. Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
  40. Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
  41. Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
  42. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693 (2012).
  43. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212 (2015).
  44. van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
  45. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  46. Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
  47. Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
  48. Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
  49. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472 (2013).
  50. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  51. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
  52. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  53. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
  54. Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D'Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
  56. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  57. Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115 (2017).
  58. Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807 (2016).
  59. Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
  60. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683 (2014).
  61. Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
  62. Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
  63. Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
  64. Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
  65. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514 (2014).
  66. Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).

Tags

Isolering av livskraftiga fettceller stromal vaskulär fraktion RNA-analys makrofagfenotypning visceral fettvävnad metaboliskt organ mogna fettceller bioaktiva molekyler immunprocesser fettvävnadens patofysiologi isoleringssteg felsökningsriktlinjer kollagenas enzymatisk matsmältningsteknik makrofagundergrupper genuttrycksstudier encellssuspension mogen fettcells-RNA-isolering
Isolering av livskraftiga adipocyter och stromal vaskulär fraktion från human visceral fettvävnad lämplig för RNA-analys och makrofagfenotypning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Estrada-Gutierrez, G., Bravo-Flores, … More

Estrada-Gutierrez, G., Bravo-Flores, E., Ortega-Castillo, V., Flores-Rueda, V., Mancilla-Herrera, I., Espino Y Sosa, S., Sánchez-Martínez, M., Perichart-Perera, O., Solis-Paredes, M. Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping. J. Vis. Exp. (164), e61884, doi:10.3791/61884 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

PLAYLIST
Diagnostic Procedure

  • Research • Medicine
    Estimation of Urinary Nanocrystals in Humans using Calcium Fluorophore Labeling and Nanoparticle Tracking Analysis
  • Research • Medicine
    Development and Evaluation of 3D-Printed Cardiovascular Phantoms for Interventional Planning and Training
  • Research • Medicine
    Human Fetal Blood Flow Quantification with Magnetic Resonance Imaging and Motion Compensation
  • Research • Medicine
    Digital Handwriting Analysis of Characters in Chinese Patients with Mild Cognitive Impairment
  • Research • Medicine
    Segmentation and Linear Measurement for Body Composition Analysis using Slice-O-Matic and Horos
  • Research • Medicine
    Magnetic Resonance Imaging of Multiple Sclerosis at 7.0 Tesla
  • Research • Medicine
    Real-Time Magnetic Resonance Guided Focused Ultrasound for Painful Bone Metastases
  • Research • Medicine
    Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping
  • Research • Medicine
    Obtaining Quality Extended Field-of-View Ultrasound Images of Skeletal Muscle to Measure Muscle Fascicle Length
  • Research • Medicine
    Lung CT Segmentation to Identify Consolidations and Ground Glass Areas for Quantitative Assesment of SARS-CoV Pneumonia
  • Research • Medicine
    Electroretinogram Recording for Infants and Children under Anesthesia to Achieve Optimal Dark Adaptation and International Standards
  • Research • Medicine
    Measurement of Tissue Oxygenation Using Near-Infrared Spectroscopy in Patients Undergoing Hemodialysis
  • Research • Medicine
    Evaluation of Capnography Sampling Line Compatibility and Accuracy when Used with a Portable Capnography Monitor
  • Research • Medicine
    Simultaneous Laryngopharyngeal and Conventional Esophageal pH Monitoring
  • Research • Medicine
    Real-Time Monitoring of Neurocritical Patients with Diffuse Optical Spectroscopies
  • Research • Neuroscience
    Evaluating Postural Control and Lower-extremity Muscle Activation in Individuals with Chronic Ankle Instability
  • Research • Medicine
    Assessment of Dependence in Activities of Daily Living Among Older Patients in an Acute Care Unit
  • Research • Medicine
    Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples
  • Research • Medicine
    International Expert Consensus and Recommendations for Neonatal Pneumothorax Ultrasound Diagnosis and Ultrasound-guided Thoracentesis Procedure
  • Research • Biology
    A Finite Element Approach for Locating the Center of Resistance of Maxillary Teeth
  • Research • Medicine
    Lower Limb Biomechanical Analysis of Healthy Participants
  • Research • Neuroscience
    Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential
  • Research • Medicine
    Oral Health Assessment by Lay Personnel for Older Adults
  • Research • Medicine
    Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion
  • Research • Medicine
    A Whole Body Dosimetry Protocol for Peptide-Receptor Radionuclide Therapy (PRRT): 2D Planar Image and Hybrid 2D+3D SPECT/CT Image Methods
  • Research • Medicine
    Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer
  • Research • Medicine
    Assessment of Static Graviceptive Perception in the Roll-Plane using the Subjective Visual Vertical Paradigm
  • Research • Medicine
    Learning Modern Laryngeal Surgery in a Dissection Laboratory
  • Research • Medicine
    DIPLOMA Approach for Standardized Pathology Assessment of Distal Pancreatectomy Specimens
  • Research • Medicine
    A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills
  • Research • Medicine
    Imaging Features of Systemic Sclerosis-Associated Interstitial Lung Disease
  • Research • Medicine
    Integrating Augmented Reality Tools in Breast Cancer Related Lymphedema Prognostication and Diagnosis
  • Research • Medicine
    Ultrasonographic Assessment During Cardiopulmonary Resuscitation
  • Research • Medicine
    Measurement of the Hepatic Venous Pressure Gradient and Transjugular Liver Biopsy
  • Research • Medicine
    Patient Directed Recording of a Bipolar Three-Lead Electrocardiogram using a Smartwatch with ECG Function
  • Research • Medicine
    Traditional Trail Making Test Modified into Brand-new Assessment Tools: Digital and Walking Trail Making Test
  • Research • Medicine
    Use of Magnetic Resonance Imaging and Biopsy Data to Guide Sampling Procedures for Prostate Cancer Biobanking
  • Research • Medicine
    A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids
  • Research • Medicine
    A Novel Non-invasive Method for the Detection of Elevated Intra-compartmental Pressures of the Leg
  • Research • Medicine
    Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent
  • Research • Neuroscience
    Portable Thermographic Screening for Detection of Acute Wallenberg's Syndrome
  • Research • Medicine
    Use of MRI-ultrasound Fusion to Achieve Targeted Prostate Biopsy
  • Research • Medicine
    Testing of all Six Semicircular Canals with Video Head Impulse Test Systems
  • Research • Medicine
    Protocol and Guidelines for Point-of-Care Lung Ultrasound in Diagnosing Neonatal Pulmonary Diseases Based on International Expert Consensus
  • Research • Neuroscience
    Bilateral Assessment of the Corticospinal Pathways of the Ankle Muscles Using Navigated Transcranial Magnetic Stimulation
  • Research • Medicine
    Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy
  • Research • Medicine
    Multi-Modal Home Sleep Monitoring in Older Adults
  • Research • Medicine
    Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques
  • Research • Medicine
    Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies
  • Research • Medicine
    Measurements of Motor Function and Other Clinical Outcome Parameters in Ambulant Children with Duchenne Muscular Dystrophy
  • Research • Medicine
    Assessment of the Efficacy of An Osteopathic Treatment in Infants with Biomechanical Impairments to Suckling
  • Research • Medicine
    Quantification of Levator Ani Hiatus Enlargement by Magnetic Resonance Imaging in Males and Females with Pelvic Organ Prolapse
  • Research • Medicine
    Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain
  • Research • Medicine
    Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling
  • Research • Medicine
    Proton Therapy Delivery and Its Clinical Application in Select Solid Tumor Malignancies
  • Research • Medicine
    Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship
  • Research • Medicine
    Two-Dimensional X-Ray Angiography to Examine Fine Vascular Structure Using a Silicone Rubber Injection Compound
  • Research • Medicine
    Preparation, Procedures and Evaluation of Platelet-Rich Plasma Injection in the Treatment of Knee Osteoarthritis
  • Research • Medicine
    Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla
  • Research • Medicine
    Semi-quantitative Assessment Using [18F]FDG Tracer in Patients with Severe Brain Injury
  • Research • Medicine
    Handheld Metal Detector Screening for Metallic Foreign Body Ingestion in Children
  • Research • Medicine
    Conducting Maximal and Submaximal Endurance Exercise Testing to Measure Physiological and Biological Responses to Acute Exercise in Humans
  • Research • Medicine
    A Metadata Extraction Approach for Clinical Case Reports to Enable Advanced Understanding of Biomedical Concepts
  • Research • Medicine
    Autonomic Function Following Concussion in Youth Athletes: An Exploration of Heart Rate Variability Using 24-hour Recording Methodology
  • Research • Medicine
    Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis
  • Research • Medicine
    Objective Nociceptive Assessment in Ventilated ICU Patients: A Feasibility Study Using Pupillometry and the Nociceptive Flexion Reflex
  • Research • Medicine
    'Boden Food Plate': Novel Interactive Web-based Method for the Assessment of Dietary Intake
  • Research • Medicine
    Anogenital Distance and Perineal Measurements of the Pelvic Organ Prolapse (POP) Quantification System
  • Research • Medicine
    Bedside Ultrasound for Guiding Fluid Removal in Patients with Pulmonary Edema: The Reverse-FALLS Protocol
  • Research • Medicine
    Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations
  • Research • Medicine
    Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae
  • Research • Medicine
    Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy
  • Research • Medicine
    Collecting Hair Samples for Hair Cortisol Analysis in African Americans
  • Research • Medicine
    In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Menière's Disease Ears and Normal Hearing Ears
  • Research • Medicine
    Measuring the Carotid to Femoral Pulse Wave Velocity (Cf-PWV) to Evaluate Arterial Stiffness
  • Research • Medicine
    Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)
  • Research • Medicine
    Taste Exam: A Brief and Validated Test
  • Research • Medicine
    Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples
  • Research • Medicine
    Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing
  • Research • Medicine
    Electrophysiological Measurement of Noxious-evoked Brain Activity in Neonates Using a Flat-tip Probe Coupled to Electroencephalography
  • Research • Medicine
    A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients
  • Research • Medicine
    Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children
  • Research • Medicine
    Using Retinal Imaging to Study Dementia
  • Research • Medicine
    Application of an Amplitude-integrated EEG Monitor (Cerebral Function Monitor) to Neonates
  • Research • Medicine
    3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue
  • Research • Medicine
    The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo
  • Research • Medicine
    A Component-resolved Diagnostic Approach for a Study on Grass Pollen Allergens in Chinese Southerners with Allergic Rhinitis and/or Asthma
  • Research • Medicine
    A Novel Method: Super-selective Adrenal Venous Sampling
  • Research • Medicine
    A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers
  • Research • Medicine
    Non-invasive Assessments of Subjective and Objective Recovery Characteristics Following an Exhaustive Jump Protocol
  • Research • Medicine
    Experimental Protocol of a Three-minute, All-out Arm Crank Exercise Test in Spinal-cord Injured and Able-bodied Individuals
  • Research • Medicine
    Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle
  • Research • Medicine
    Assessment of Pulmonary Capillary Blood Volume, Membrane Diffusing Capacity, and Intrapulmonary Arteriovenous Anastomoses During Exercise
  • Research • Medicine
    Assessment of Child Anthropometry in a Large Epidemiologic Study
  • Research • Medicine
    Video Movement Analysis Using Smartphones (ViMAS): A Pilot Study
  • Research • Medicine
    Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients
  • Research • Medicine
    A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans
  • Research • Medicine
    Interictal High Frequency Oscillations Detected with Simultaneous Magnetoencephalography and Electroencephalography as Biomarker of Pediatric Epilepsy
  • Research • Medicine
    Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans
  • Research • Medicine
    A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device
  • Research • Medicine
    Drug-Induced Sleep Endoscopy (DISE) with Target Controlled Infusion (TCI) and Bispectral Analysis in Obstructive Sleep Apnea
  • Research • Medicine
    Integrated Compensatory Responses in a Human Model of Hemorrhage
  • Research • Medicine
    Transthoracic Speckle Tracking Echocardiography for the Quantitative Assessment of Left Ventricular Myocardial Deformation
  • Research • Medicine
    Impression Cytology of the Lid Wiper Area
  • Research • Behavior
    A Protocol of Manual Tests to Measure Sensation and Pain in Humans
  • Research • Medicine
    Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples
  • Research • Medicine
    A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side
  • Research • Medicine
    Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile
  • Research • Medicine
    Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing
  • Research • Medicine
    Ultrasound Assessment of Endothelial Function: A Technical Guideline of the Flow-mediated Dilation Test
  • Research • Medicine
    Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera
  • Research • Medicine
    Intravenous Endotoxin Challenge in Healthy Humans: An Experimental Platform to Investigate and Modulate Systemic Inflammation
  • Research • Medicine
    Modeling and Simulations of Olfactory Drug Delivery with Passive and Active Controls of Nasally Inhaled Pharmaceutical Aerosols
  • Research • Medicine
    Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool
  • Research • Medicine
    A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy
  • Research • Medicine
    Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Toddlers - Resting and Developmental Challenges
  • Research • Medicine
    Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function
  • Research • Medicine
    Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases
  • Research • Medicine
    Diagnosis of Musculus Gastrocnemius Tightness - Key Factors for the Clinical Examination
  • Research • Medicine
    Stereo-Electro-Encephalo-Graphy (SEEG) With Robotic Assistance in the Presurgical Evaluation of Medical Refractory Epilepsy: A Technical Note
  • Research • Medicine
    Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease
  • Research • Medicine
    Transcutaneous Microcirculatory Imaging in Preterm Neonates
  • Research • Medicine
    Using an Ingestible Telemetric Temperature Pill to Assess Gastrointestinal Temperature During Exercise
  • Research • Medicine
    Design, Fabrication, and Administration of the Hand Active Sensation Test (HASTe)
  • Research • Medicine
    MRI-guided dmPFC-rTMS as a Treatment for Treatment-resistant Major Depressive Disorder
  • Research • Medicine
    Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion
  • Research • Medicine
    A Multicenter MRI Protocol for the Evaluation and Quantification of Deep Vein Thrombosis
  • Research • Medicine
    Determining The Electromyographic Fatigue Threshold Following a Single Visit Exercise Test
  • Research • Medicine
    Use of Electromagnetic Navigational Transthoracic Needle Aspiration (E-TTNA) for Sampling of Lung Nodules
  • Research • Medicine
    Trabecular Meshwork Response to Pressure Elevation in the Living Human Eye
  • Research • Medicine
    In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses
  • Research • Medicine
    Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy
  • Research • Medicine
    Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images
  • Research • Medicine
    Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy
  • Research • Medicine
    A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology
  • Research • Medicine
    Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
  • Research • Medicine
    State of the Art Cranial Ultrasound Imaging in Neonates
  • Research • Medicine
    Measurement of Dynamic Scapular Kinematics Using an Acromion Marker Cluster to Minimize Skin Movement Artifact
  • Research • Medicine
    The Supraclavicular Fossa Ultrasound View for Central Venous Catheter Placement and Catheter Change Over Guidewire
  • Research • Medicine
    Ultrasound Assessment of Endothelial-Dependent Flow-Mediated Vasodilation of the Brachial Artery in Clinical Research
  • Research • Medicine
    Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging
  • Research • Medicine
    A Neuroscientific Approach to the Examination of Concussions in Student-Athletes
  • Research • Medicine
    DTI of the Visual Pathway - White Matter Tracts and Cerebral Lesions
  • Research • Medicine
    Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples
  • Research • Medicine
    Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies
  • Research • Medicine
    A Multi-Modal Approach to Assessing Recovery in Youth Athletes Following Concussion
  • Research • Medicine
    Clinical Assessment of Spatiotemporal Gait Parameters in Patients and Older Adults
  • Research • Medicine
    Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue
  • Research • Medicine
    Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing
  • Research • Medicine
    Fast and Accurate Exhaled Breath Ammonia Measurement
  • Research • Medicine
    Developing Neuroimaging Phenotypes of the Default Mode Network in PTSD: Integrating the Resting State, Working Memory, and Structural Connectivity
  • Research • Medicine
    Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens
  • Research • Medicine
    Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease
  • Research • Medicine
    Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing
  • Research • Medicine
    Network Analysis of the Default Mode Network Using Functional Connectivity MRI in Temporal Lobe Epilepsy
  • Research • Medicine
    EEG Mu Rhythm in Typical and Atypical Development
  • Research • Medicine
    The Multiple Sclerosis Performance Test (MSPT): An iPad-Based Disability Assessment Tool
  • Research • Medicine
    Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples
  • Research • Medicine
    Dynamic Visual Tests to Identify and Quantify Visual Damage and Repair Following Demyelination in Optic Neuritis Patients
  • Research • Medicine
    Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas
  • Research • Medicine
    Utility of Dissociated Intrinsic Hand Muscle Atrophy in the Diagnosis of Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • Research • Medicine
    Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly
  • Research • Medicine
    Pulse Wave Velocity Testing in the Baltimore Longitudinal Study of Aging
  • Research • Medicine
    Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters
  • Research • Medicine
    3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient's Brain During a Spontaneous Migraine Headache
  • Research • Medicine
    A Novel Application of Musculoskeletal Ultrasound Imaging
  • Research • Medicine
    Computerized Dynamic Posturography for Postural Control Assessment in Patients with Intermittent Claudication
  • Research • Medicine
    Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers
  • Research • Medicine
    Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases
  • Research • Medicine
    Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl
  • Research • Medicine
    Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens
  • Research • Medicine
    Evaluation of Respiratory Muscle Activation Using Respiratory Motor Control Assessment (RMCA) in Individuals with Chronic Spinal Cord Injury
  • Research • Medicine
    Minimal Erythema Dose (MED) Testing
  • Research • Medicine
    Measuring Cardiac Autonomic Nervous System (ANS) Activity in Children
  • Research • Medicine
    Collecting And Measuring Wound Exudate Biochemical Mediators In Surgical Wounds
  • Research • Medicine
    A Research Method For Detecting Transient Myocardial Ischemia In Patients With Suspected Acute Coronary Syndrome Using Continuous ST-segment Analysis
  • Research • Medicine
    Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
  • Research • Medicine
    Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides
  • Research • Medicine
    In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes
  • Research • Medicine
    Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism
  • Research • Medicine
    Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats
  • Research • Medicine
    Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield
  • Research • Medicine
    Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants
  • Research • Medicine
    Tilt Testing with Combined Lower Body Negative Pressure: a "Gold Standard" for Measuring Orthostatic Tolerance
  • Research • Medicine
    Driving Simulation in the Clinic: Testing Visual Exploratory Behavior in Daily Life Activities in Patients with Visual Field Defects
  • Research • Medicine
    Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods
  • Research • Medicine
    Portable Intermodal Preferential Looking (IPL): Investigating Language Comprehension in Typically Developing Toddlers and Young Children with Autism
  • Research • Medicine
    Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity
  • Research • Medicine
    The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease
  • Research • Medicine
    Collection Protocol for Human Pancreas
  • Research • Medicine
    The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva
  • Research • Medicine
    The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia
  • Research • Medicine
    Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty
  • Research • Medicine
    Quantification of Atherosclerotic Plaque Activity and Vascular Inflammation using [18-F] Fluorodeoxyglucose Positron Emission Tomography/Computed Tomography (FDG-PET/CT)
  • Research • Medicine
    Eye Tracking Young Children with Autism
  • Research • Medicine
    Doppler Optical Coherence Tomography of Retinal Circulation
  • Research • Medicine
    Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System
  • Research • Medicine
    Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR
  • Research • Medicine
    Method to Measure Tone of Axial and Proximal Muscle
  • Research • Medicine
    The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress
  • Research • Medicine
    Probing the Brain in Autism Using fMRI and Diffusion Tensor Imaging
  • Research • Medicine
    Multifocal Electroretinograms
  • Research • Medicine
    Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients
  • Research • Medicine
    Examining the Characteristics of Episodic Memory using Event-related Potentials in Patients with Alzheimer's Disease
  • Research • Medicine
    Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling
  • Research • Medicine
    Manual Muscle Testing: A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients
  • Research • Medicine
    Expired CO2 Measurement in Intubated or Spontaneously Breathing Patients from the Emergency Department
  • Research • Medicine
    A Protocol for Comprehensive Assessment of Bulbar Dysfunction in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)
  • Research • Medicine
    An Investigation of the Effects of Sports-related Concussion in Youth Using Functional Magnetic Resonance Imaging and the Head Impact Telemetry System
  • Research • Medicine
    Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies
  • Research • Medicine
    Methods to Quantify Pharmacologically Induced Alterations in Motor Function in Human Incomplete SCI
  • Research • Medicine
    Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology
  • Research • Medicine
    Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue
  • Research • Medicine
    Assessing Endothelial Vasodilator Function with the Endo-PAT 2000
  • Research • Medicine
    Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery
  • Research • Medicine
    An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)
  • Research • Biology
    Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees
  • Research • Biology
    Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

    • Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter