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Artigo de método

Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular

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DOI:

10.3791/61897

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9 de novembro de 2020

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Neste artigo

Resumo

Descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês, que combina polinizações de campo e laboratório e observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência com a identificação de S-genótipos pela PCR e o monitoramento da floração para a seleção de polinizadores.

Resumo

As cultivares japonesas de ameixa comumente cultivadas são híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a salicina prunus original com outras espécies de Prunus. A maioria dos híbridos exibe autoincompatibilidade gametofítica, que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locus que contém vários alelos. A maioria dos híbridos cultivados são auto-incompatíveis e precisam de pólen de um doador compatível para fertilizar suas flores. O estabelecimento de requisitos de polinização na ameixa japonesa está se tornando cada vez mais importante devido ao alto número de novas cultivares com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por polinizações manuais tanto no campo quanto no laboratório, seguida pelo monitoramento do alongamento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência, e também pelo monitoramento da maturação da fruta no campo. A seleção de cultivares polinizadores é avaliada pela combinação da identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo. Conhecer os requisitos de polinização das cultivares facilita a seleção de cultivares para a concepção de novos pomares e permite a detecção precoce de problemas de produtividade relacionados à deficiência de polinização em pomares estabelecidos.

Introdução

A ameixa japonesa(Prunus salicina Lindl.) é nativa da China1. No séculoXIX, esta cultura foi introduzida do Japão para os Estados Unidos, onde foi intercalada com outras ameixas diploides norte-americanas2. No séculoXX, alguns desses híbridos foram espalhados para regiões temperadas ao redor do mundo. Atualmente, o termo "ameixa japonesa" refere-se a uma ampla gama de híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a Salicina P. original com até 15 outros diploides Prunus spp.3,4,5<....

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Protocolo

1. Polinização manual no campo

  1. Extração de pólen
    1. Para obter pólen, colete botões de flores no estágio D24,de acordo com o estágio 57 na escalaBBCH 25,26.
      NOTA: Mais botões de flores são necessários na ameixa japonesa do que em outras espécies de Prunus porque seus anteros produzem menos pólen.
    2. Retire os anteás usando uma malha plástica (tamanho de poros de 2 mm x 2 mm) e coloque-os no papel em temperatura ambiente por 24 h até que o anther deiscência.
    3. Peneirar os grãos de pólen através de uma malha fina (0,26 mm x 0....

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Resultados

Cada broto de flor de ameixa japonês contém uma inflorescência com 1-3 flores. Como em outras espécies de frutas de pedra, cada flor é composta de quatro prostitutas: carpel, estamens, pétalas e sepalas, que são fundidas formando um copo na base da flor. As estruturas florais são menores do que outras frutas de pedra, com um mitil curto e frágil cercado pelos estamens que contêm uma pequena quantidade de grãos de pólen. Em plena floração, as flores de cada inflorescência aparecem separadas em talos curtos, mostrando as p.......

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Discussão

A metodologia aqui descrita para os requisitos de polinização das cultivares japonesas de ameixa requer determinar a auto-(in)compatibilidade de cada cultivar por polinizações controladas no campo ou no laboratório, e a observação subsequente do crescimento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência. As relações de incompatibilidade são estabelecidas pela caracterização dos S-alelos por genotipagem molecular. Por fim, a seleção de polinizadores é realizada pela fenoologia de monitoramento para detectar as.......

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Investigação y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Fundo Social Europeu, União Europeia (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plano Regional de Investigação (IB16181), Grupo de Investigação (AGA001, GR18196). O B.I. Guerrero foi apoiado por uma bolsa do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología do México (CONACYT, 471839).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoGlacial Panreac131008.1611
ÁgariNtRON Biotecnologia25999
Azul de anilinaDifco8504-88
Ácido bórico (H3BO4)Panreac131015.1210
Nitrato de cálcio 4-hidrato (Ca(NO3)2 · 4H2O)Panreac131231.1211
CoverglassDeltalabD10246024 mm x 60 mm
Camera Imaging Developmet SystemsUI-1490SE
Camera Software SuiteImaging Developmet Systems4.93.0.
DNA OligosThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM cadaThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq Green DNA polimeraseThermoFisher ScientificEP0713
Etanol 96°VWR-Chemicals83804.360
1Kb DNA Ladder (Patente dos EUA No. 4.403.036) (500pb-12Kb)Invitrogen15615-016Tamanho: 250µ g; Conc: 1.0 µ g/µ l
Sistema de Documentação de GelBio-Rad1708195
Contador de MãosTamacoTM-4
Software de Laboratório de ImagensSistema de Análise de Imagem Bio-Radpara Sistema de Documentação de Gel
MetaPhor AgaroseLonza50180
Microcentrífuga 5415 RZ605212Eppendorf
com UV epifluescênciaLeicaDM2500Filtro excitador BP340-390, Filtro de barreira LP425
MicroslidesDeltalabD10000426 mm x 76 mm
Mini Sistema de EletroforeseFisherbrand14955170
MinicentrífugaThermoFisher Scientific15334204
NanoDrop 1000 EspectrofotômetroThermoFisher ScientificND1000
Placas de PetriDeltalab20020155 mm x 14 mm
Fosfato de Potássio Tribásico (K3PO4· 1.5H2O)Panreac141513
Primer para a frente 'Pru C2'ThermoFisherScientific
Primer para a frente Pru T2'ThermoFisherScientific
Primer reverso 'PCER'ThermoFisherScientific
RedSafe Solução de coloração de ácido nucleicoiNtRON Biotechnology21141
SacarosePanreac131621.1211
Sulfito de sódio anidro (Na2SO3)Panreac131717.1211
Kit de extração de DNA de plantas SpeedtoolsBiotools21272
TBE Buffer (10X)PanreacA0972,5000PE
Termociclador T100Bio-Rad
Thermomixer comfortEppendorfT1317
Autoclave Vertical Presoclave IIJP Selecta4001725
VortexFisherbrand11746744
Digital Digital Microscópio 1861096

Referências

  1. Hendrick, U. P. The Plums of New York. , J. B. Lyon Co., State Printers. (1911).
  2. Okie, W. R., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. Hancock, J. F. , Springer. Dordrecht. 337-357 (2008).
  3. Guerra, M. E., Rodrigo, J.

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Reimpressões e permissões

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