البراز (الصغير) عزل الحمض النووي الريبي
Summary
يعزل هذا البروتوكول الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من عينات البراز من الحيوانات والبشر. يتم استخدام مجموعة عزل miRNA التجارية مع تكيف كبير لعزل الحمض النووي الريبي النقي بكمية وجودة محسنة. تعتبر عزلات الحمض النووي الريبي جيدة لمعظم فحوصات الحمض النووي الريبي النهائية مثل التسلسل والمصفوفات الدقيقة و RT-PCR.
Abstract
أصبح من الواضح أن الحمض النووي الريبي موجود في تجويف الأمعاء والبراز في الحيوانات والبشر. يعزل البروتوكول الموصوف أدناه إجمالي الحمض النووي الريبي بما في ذلك الحمض النووي الريبي الميكروي من عينات البراز من الحيوانات والبشر. الهدف هو عزل الحمض النووي الريبي الكلي بنقاوة وكمية عالية للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول الأمثل في عزل miRNA في قدرات عزل منتجات الحمض النووي الريبي عالية النقاء مع خطوات غسيل إضافية موصوفة ، وزيادة كمية الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بطريقة محسنة في إعادة تعليق العينة ، ونصائح مهمة لإزالة التلوث. أحد القيود هو عدم القدرة على معالجة وتنقية عينة أكبر من أكثر من 200 ملغ لأن أحجام العينات هذه قد تسبب صعوبة في التكوين الواضح للطور البيني. وبالتالي ، فإن حجم العينة الكبير قد يلوث المرحلة المائية المراد استخراجها كما هو موضح في البروتوكول مع المواد العضوية التي تؤثر على جودة الحمض النووي الريبي المعزول في النهاية. ومع ذلك ، فإن عزلات الحمض النووي الريبي من عينة تصل إلى 200 ملغ كافية لمعظم التحليلات النهائية.
Introduction
يتم التعرف على الحمض النووي الريبي خارج الخلية كعامل مهم يتوسط العديد من العمليات البيولوجية1. تم الإبلاغ عن الحمض النووي الريبي خارج الخلية في البراز لأول مرة في عام 2008 كعلامة لسرطان القولون والتهاب القولون التقرحيالنشط 2 ، وتم الكشف عنه مؤخرا كمكون طبيعي لتجويف الأمعاء والبراز ويتوسط اتصالات ميكروب المضيف3،4،5. الغرض من بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي هذا هو استخراج الحمض النووي الريبي خارج الخلية عالي الجودة من عينات البراز التي تم جمعها من الحيوانات والبشر. تم تكييف البروتوكول من مجموعة عزل miRNA التجارية. يتم استخدام الحمض النووي الريبي المكتسب لتحليلات المصب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، RT-PCR ، والمصفوفات الدقيقة. يتضمن البروتوكول العديد من النصائح المهمة والمفيدة لتعظيم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي الموجود في براز الحيوانات والبشر. السبب في تطوير وتحسين هذه الطريقة لعزل الحمض النووي الريبي (بما في ذلك microRNA) هو تقليل الحمض النووي الريبي الميكروبي في البراز ، والحد من المتغيرات في الدراسات البحثية وتحليل تكوين الحمض النووي الريبي في الأمعاء دون حساب مختلف العوامل المربكة ومصادر التلوث. تجدر الإشارة إلى أن عزل الحمض النووي الريبي هذا يقلل من إطلاق الحمض النووي الريبي من الخلايا الحية والميكروبات الحية (الحمض النووي الريبي الخلوي). وهو يركز على الحمض النووي الريبي خارج الخلية التي تم إطلاقها بواسطة خلايا الأمعاء أو تم الحصول عليها عن طريق تناول الطعام. بشكل أساسي ، هذه الطريقة ليست مناسبة للدراسات التي يتم فيها فحص النسخ الميكروبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
من المهم استخدام تقنية خالية من RNase لمنع تلوث RNase أثناء العزل7. بعد الطرد المركزي وتشكيل الطور البيني المضغوط ، من المهم تجنب الطور البيني والمرحلة السفلية وملوث الجسيمات العائم على قمة الطور المائي عند استعادة المرحلة المائية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة خطوتين للغسيل بمحلو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقينا مساعدة فنية من مرفق البوليمرات الحيوية في كلية الطب بجامعة هارفارد للمحلل الحيوي. تم دعم هذا العمل من خلال منحة أبحاث الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد RG-1707-28516 (H.L.W. و S.L.).
Materials
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
- Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
- Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
- Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
- Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
- Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
- Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
- Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
- Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn’s disease biomarkers. Crohn’s & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
- Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
- Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
- Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
- Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
- Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
- Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
