Xenopus laevis | Voorbereiding van ei-extract en live beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie
Summary
We beschrijven een methode voor de bereiding en live beeldvorming van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren .
Abstract
Xenopus laevis ei-extracten, die traditioneel worden gebruikt voor biochemische bulktests, zijn naar voren gekomen als een krachtig op beeldvorming gebaseerd hulpmiddel voor het bestuderen van cytoplasmatische verschijnselen, zoals cytokinese, mitotische spindelvorming en assemblage van de kern. Voortbouwend op vroege methoden die vaste extracten in beeld brachten die op schaarse tijdstippen waren bemonsterd, beeldden recente benaderingen live-extracten af met behulp van time-lapse-microscopie, waarbij meer dynamische kenmerken met verbeterde temporele resolutie werden onthuld. Deze methoden vereisen meestal geavanceerde oppervlaktebehandelingen van het beeldvormende vat. Hier introduceren we een alternatieve methode voor live beeldvorming van ei-extracten die geen chemische oppervlaktebehandeling vereisen. Het is eenvoudig te implementeren en maakt gebruik van in massa geproduceerde laboratorium verbruiksartikelen voor beeldvorming. We beschrijven een systeem dat kan worden gebruikt voor zowel wide-field als confocale microscopie. Het is ontworpen voor het afbeelden van extracten in een 2-dimensionaal (2D) veld, maar kan eenvoudig worden uitgebreid naar beeldvorming in 3D. Het is zeer geschikt voor het bestuderen van ruimtelijke patroonvorming binnen het cytoplasma. Met representatieve gegevens demonstreren we de typische dynamische organisatie van microtubuli, kernen en mitochondriën in interfase-extracten die met deze methode zijn bereid. Deze beeldgegevens kunnen kwantitatieve informatie verschaffen over cytoplasmatische dynamica en ruimtelijke organisatie.
Introduction
Het cytoplasma vormt het hoofdvolume van een cel en heeft een aparte organisatie. De ingrediënten van het eukaryote cytoplasma kunnen zichzelf assembleren tot een breed scala aan ruimtelijke structuren, zoals microtubule-asters en het Golgi-apparaat, die op hun beurt dynamisch worden gerangschikt en omgedraaid, afhankelijk van de identiteit en fysiologische toestand van de cel. Het begrijpen van de ruimtelijke organisatie van het cytoplasma en de link met cellulaire functies is dus belangrijk om te begrijpen hoe de cel werkt. Xenopus laevis ei-extracten worden traditioneel gebruikt voor biochemische bulktests 1,2,3,4,5,6,7,8, maar recent werk vestigt ze als een krachtig live beeldvormingssysteem voor mechanistische studies van cytoplasmatische structuren en hun cellulaire functies 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Deze onverdunde extracten behouden vele structuren en functies van het cytoplasma, terwijl ze directe manipulaties van cytoplasmatische inhoud mogelijk maken die niet haalbaar zijn in conventionele celgebaseerde modellen 19,20. Dit maakt ze ideaal voor het karakteriseren van cytoplasmatische verschijnselen en het ontleden van hun mechanistische onderbouwing.
Bestaande methoden voor het afbeelden van extracten vereisen chemische oppervlaktemodificaties of fabricage van microfluïdische apparaten. Een op coverslip gebaseerde methode vereist polyethyleenglycol (PEG) passivering van glazen coverslips21. Een op micro-emulsie gebaseerde methode vereist dampafzetting van trichlooriso (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan op glasoppervlakken22,23. Microfluïdische systemen maken nauwkeurige controle van het volume, de geometrie en de samenstelling van extractdruppels mogelijk, maar vereisen gespecialiseerde microfabricagefaciliteiten 11,12,24.
Hier introduceren we een alternatieve methode voor het afbeelden van ei-extracten die gemakkelijk te implementeren is en gebruik maakt van direct beschikbare, goedkope materialen. Dit omvat de voorbereiding van een beeldkamer met een dia en een coverslip bedekt met gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) tape. De kamer kan worden gebruikt voor beeldvormingsextracten met een verscheidenheid aan microscopiesystemen, waaronder stereoscopen en rechtopstaande en omgekeerde microscopen. Deze methode vereist geen chemische behandeling van oppervlakken, terwijl een vergelijkbare optische helderheid wordt bereikt die wordt verkregen met bestaande op glas gebaseerde methoden die hierboven zijn besproken. Het is ontworpen om een laag extracten met een uniforme dikte over een 2D-veld af te beelden en kan eenvoudig worden uitgebreid om een 3D-volume aan extracten af te beelden. Het is zeer geschikt voor time-lapse beeldvorming van collectief cytoplasmatisch gedrag over een groot gezichtsveld.
We hebben interfase-arrested ei-extracten gebruikt om onze beeldvormingsmethode te demonstreren. Het extractpreparaat volgt het protocol van Deming en Kornbluth19. Kortom, eieren die van nature zijn gearresteerd in de metafase van meiose II worden verpletterd door een spin met lage snelheid. Deze spin bevrijdt het cytoplasma van meiotische arrestatie en laat het extract in de interfase gaan. Normaal gesproken wordt cytochalasine B toegevoegd voorafgaand aan de verpletterende spin om de vorming van F-actine te remmen. Het kan echter worden weggelaten als F-actine gewenst is. Cycloheximide wordt ook toegevoegd voorafgaand aan de breekspin om te voorkomen dat het interfase-extract de volgende mitose binnendringt. De extracten worden vervolgens in de eerder genoemde beeldvormende kamers geplaatst en op een microscoop gelegd. Ten slotte worden beelden in de loop van de tijd met gedefinieerde intervallen opgenomen door een camera die op de microscoop is aangesloten, waardoor time-lapse-beeldreeksen worden geproduceerd die het dynamische gedrag van het extract in een 2D-veld vastleggen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis ei-extracten zijn naar voren gekomen als een krachtig modelsysteem voor op beeldvorming gebaseerde studies van verschillende subcellulaire structuren 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 en cytoplasmatische organisatie op een geheel </s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken J. Kamenz, Y. Chen en W. Y. C. Huang voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 en R35 GM131792) toegekend aan James E. Ferrell, Jr.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
