I denne publikation beskriver vi protokoller til vurdering af luftvejes mucociliary clearance (MCC) hos mus in vivo ved hjælp af dual-modality radionuclide imaging. Denne protokol er designet til en enkelt foton emission computertomografi (SPECT) og computertomografi (CT) erhvervelse protokol ved hjælp af musen hele kroppen (MWB) collimators i en dobbelt SPECT / CT-system.
Respiratorisk motile cilia, specialiserede organeller i cellen, linje den apikale overflade epitelceller foring luftvejene. Ved at slå i en metakronal, synkronal måde, disse mange, motile, actin-baserede organeller generere en cephalad væske flow rydde luftvejene af inhalerede forurenende stoffer og patogener. Med stigende miljøforurening, nye viruspatogener og nye multiresistente bakterier er cilia-genereret slimhinderydning (MCC) afgørende for at opretholde lungesundheden. MCC er også deprimeret i flere medfødte lidelser som primær ciliary dyskinesi, cystisk fibrose samt erhvervet lidelser som kronisk obstruktiv lungesygdom. Alle disse lidelser har etableret, i nogle tilfælde flere, musemodeller. I denne publikation beskriver vi en metode, der bruger en lille mængde radioaktivitet og dual-modality SPECT/CT-billeddannelse til nøjagtigt og reproducerbart at måle MCC hos mus in vivo. Metoden giver mulighed for genvinding af mus efter billeddannelse, hvilket gør seriemålinger mulige og tester potentielle terapeutiske langsgående over tid. Dataene i mus af vild type viser reproducerbarheden af MCC-målingen, så længe der lægges tilstrækkelig vægt på detaljer, og protokollen overholdes nøje.
Cilia er mikrotubule baserede cellulære organeller bevaret på tværs af evolutionære historie fra alger til mennesker. De stammer fra celleoverflader og har en række funktioner1, lige fra anerkendelse af lokale miljømæssige sensoriske signaler til motilitet, funktioner, der kan spores tilbage fra mennesker til tidlige encellede eukaryote organismer2,3. Cilia kan være ikke-motil og enkelt tjener som en celles specialiserede antenne til at behandle miljøsignaler; eller motile og flere, slå i synkroniserede, metakronal bølger til at generere væske flow, såsom i foring af æggelederne og de øvre og nedre luftveje, bortset fra terminalen bronchioles fører til alveoler1,2.
Luftvejenes omfattende epiteloverflade udsættes for en konstant spærreild af forurening i form af en række potentielt farlige inhalerede forurenende stoffer og patogener, hvilket kræver et forsvar. En vigtig forsvarsmekanisme er tracheobronchialtræets slimapparat, hvor en kontinuerlig strøm af udskillet slim mekanisk transporteres ud af luftvejene ved at slå flere motile cilia, der forer de apikale overflader af tracheo-bronkial epitelcellerne. Disse funktion til at fange inhalerede forurenende stoffer, og gennem deres kontinuerlige, synkronale slå, transportere dem cephalad4,5.
Cilia har vist sig at have nøgleroller som i udviklingen af venstre-højre mønstre i udviklingen af embryoner, hvor motile cilia på embryonale node bryde symmetri6. Mutationer i cilia-relaterede gener er blevet knyttet til sygdomme som medfødt hjertesygdom (CHD) på grund af hjertets asymmetriske struktur6. Nylige undersøgelser har rapporteret en høj forekomst af ciliary dysfunktion i luftvejene hos patienter med CHD, samt en øget forekomst af postoperative luftvejskomplikationer og kroniske luftvejssymptomer i øvre og nedre luftveje7,8,9,10. Patienter med CHD og ciliary dysfunktion, med eller uden heterotaxy, har vist sig at have øget risiko for luftvejskomplikationer og negative åndedrætsresultater postoperativt5,8,10. Ud over deres roller i signalering og udvikling, er betydningen af luftveje cilia blevet demonstreret af ciliopatier, hvoraf et godt eksempel er primær ciliary dyskinesi (PCD). PCD er en medfødt lidelse som følge af en række mutationer, der påvirker den bevægelige respiratoriske cilia, hvilket fører til tilbagevendende lungeinfektioner, bronchiectasis og potentielt behovet for lungetransplantation11. Derudover, selv om cilia er normale i cystisk fibrose (CF), mest almindelige medfødte lidelse i den kaukasiske befolkning, MCC er nedsat på grund af tyk, tyktflydende slim som følge af mutationer i CFTR genet12. Der er flere musemodeller af PCD og CF samt et stadigt stigende antal modeller af CHD. I sidste ende cilia er alsidige strukturer med mange nøgleroller, og en metode til at vurdere funktionen af motile respiratoriske cilia in vivo kan være værdifulde for præklinisk undersøgelse, og vurdere virkningerne af mutationer samt lægemidler på slimhinde clearance (MCC)13. Metoden vil også være værdifuld i vurderingen af virkningerne af nye lægemidler, genterapi eller interventioner på MCC i disse musemodeller.
Der er mange forskellige modeller, der er blevet brugt til at vurdere MCC. En bemærkelsesværdig metode indebærer brug af methylenblåt farvestof, der er blevet indpodet i bronchus, med clearance målt ved fiberoptisk måling af farvestofbevægelse14. Denne metode er begrænset af evnen til at observere farvestoffets bevægelse, hvilket er mere rutine hos mennesker end i prækliniske musemodeller. En anden bemærkelsesværdig metode er synkrotronfasekontrast røntgenbilleder (PCXI), som kan bruges til at spore individuelle partikler i en luftvej. Denne metode er forholdsvis ny og ikke almindeligt tilgængelig15. Der findes talrige ex vivo-metoder til vurdering af luftvejene ved at udskille en luftrør til videomikroskopi, men disse modeller giver kun ringe nytteværdi hos humane patienter16. Højopløsningsteknikker til ciliabilleddannelse, såsom optisk sammenhængstomografi, er begrænset på samme mådesom 17.
I denne artikel præsenterer vi en reproducerbar metode til måling af MCC in vivo, der er blevet brugt til at måle lungefrigange i utallige dyremodeller, samt undersøgelse MCC i kronisk obstruktiv lungesygdom og vurdere virkningerne af immunosuppressive lægemidler18,19. Denne metode sporer frihøjden af den radioaktive 99mtechnetium-svovl colloid (99mTc-Sc), en uopløselig partikelradiotracer, efter instillation i lungerne. Radionuklidet kan derefter spores ved hjælp af enkelt foton emission computertomografi (SPECT)18,20. Vi har yderligere raffineret denne teknik til måling af MCC ved hjælp af dobbelt modalitet SPECT og computertomografi (CT) billeddannelse med co-lokalisering af radioisotop tæller til lungerne og måle faldet i disse tæller over 6 timer. Dual-modality imaging, med co-registrering af CT og SPECT billeder giver mulighed for nøjagtig lokalisering af stråling tæller til vores region af interesse, lungerne. Selvom vi detaljeret beskriver metoden til MCC-måling hos mus, kan protokollen justeres for at studere MCC hos rotter. Collimatorerne skal justeres såvel som strålingsdosis. Efter vores mening er mus MCC-scanninger mere teknisk udfordrende på grund af den lille dyrestørrelse, men mere nyttige end rotter på grund af det store antal etablerede musemodeller af en række menneskelige lidelser. På grund af deres lavere omkostninger og vedligeholdelsesomkostninger i dyrekolonier er en større prøvestørrelse mere mulig hos mus.
Den rolle, motile respiratoriske cilia i både sygdom og udvikling fortsætter med at udvikle sig og blive bedre værdsat. Synkron, metakronal slå af flere motile cilia på den apikale overflade af celler foring tracheobronchial træet generere cephalad flow producerer slimhinde clearance eller MCC. MCC er kompromitteret i ciliopatier som PCD22, erhvervede sygdomme som KOL18, og dens betydning bliver anerkendt i CHD’er, der ikke traditionelt anses for at være ciliopatier. Nylige data har vist respiratorisk ciliary dysfunktion i både CHD med heterotaxy23 og uden heterotaxy7. En sådan motile cilia dysfunktion viste sig at oversætte til større luftvejssymptomer9 samt større postoperativ sygelighed8. De fleste, hvis ikke alle, af disse sygdomme, har musemodeller til rådighed, og vores protokol til måling af MCC hos mus er et værdifuldt værktøj, der kan bruges til at teste potentiel terapi.
Dyremodeller giver nytte for forståelse af sygdomme og udvikling af terapier. In vivo dyrebilleddannelse giver yderligere nytte med evnen til at erhverve flere datapunkter fra de samme dyr, uden at det er nødvendigt at ofre dyrene, så efterforskerne kan følge langsgående sygdomsforløb samt undersøgelsens varighed af behandlingseffekter. Musen model af MCC er blevet udviklet i løbet af årtier af flere efterforskere, i første omgang udføres på beagle hunde ved hjælp af planar scintigraphy, en todimensionel nuklear billeddannelse teknik24. Teknikken blev tilpasset til brug i mus et årti senere, efterfulgt af tilpasning til SPECT imaging et årti efter, at25,26. Udviklingen af denne teknik i musemodeller var en stor udvikling i relevansen af denne teknik på grund af tilgængeligheden af flere musemodeller af menneskelige sygdomme som PCD, hvor ciliary-funktionen ændres betydeligt. MCC er blevet vurderet i musemodeller af lunge denervation og immunosuppression, og har potentiale til at blive brugt sammen med andre modeller19,26. MCC-måleundersøgelser hos humane patienter med luftvejssygdomme som CF, astma, PCD og ciliopatier forbundet med CHD er blevet udført og har givet resultater, som teknikken kan hjælpe både undersøgelser af lungefysiologi og terapeutisk effekt13.
En vigtig del af denne protokol er opsætning af anskaffelser med de korrekte billedparametre for at erhverve nøjagtige billeder til kvantificering. En række faktorer er afgørende, når du designer SPECT-anskaffelsesindstillinger, herunder hvilke kollimatorer der bruges, antallet af fremskrivninger, der skal erhverves pr. omdrejning, og rotationstrinstørrelse. Collimator udvælgelse er en vigtig faktor i følsomheden og afviklingen af erhvervelsen, og erhvervelse indstillinger kan være nødvendigt at skræddersy til collimator, der anvendes27. Alternativt, når du bruger større dyr som rotter, skal kollimatorerne justeres. Flere pinhole collimators for eksempel er mere følsomme, men man skal være forsigtig, når du vælger et trin størrelse for at undgå overlappende fremskrivninger og forårsager uønsket multiplexing, hvilket yderligere kan øge følsomheden af erhvervelsen på bekostning af nogle billede tvetydighed, der kan forårsage genopbygning artefakter25. Genopbygning setup er også nøglen til at generere kvantificerbare billeder. MAP3D er en almindeligt anvendt iterativ rekonstruktionsalgoritme, og PSF er en fælles genopbygningsmodel. Begge er pålidelige til rekonstruktion af billeder, men der skal udvises forsigtighed, når antallet af gentagelser og undersæt indstilles. Et større antal gentagelser vil øge den beregningstid, der kræves til genopbygningen, og øge kvaliteten af genopbygningen med faldende afkast ved yderligere stigning.
For at kvantificere billeder i ImageJ er det ideelle måleværktøj RawIntDen, som udskriver sumværdien af pixel i en markering. Når spect-data kvantificeres på tværs af lunge-ROI’er af forskellig størrelse, giver brugen af RawIntDen et absolut mål for antallet og undgår at justere målingen til roi-området, ligesom middelmålingen villevære 21.
Denne teknik har en række tilknyttede fejlkilder, som investigator skal være opmærksom på, når han anvender denne teknik. En bemærkelsesværdig confounder er brugen af bedøvelsesmidler. Isoflurane er en hurtigt virkende, inhaleret bedøvelsesmiddel, som musene genvinder fra hurtigt efter afslutningen af en erhvervelse. Der skal dog sørges for at give musene rigelig tid til at komme sig i deres bure og ikke holdes bedøvet længere end nødvendigt. I vores personlige erfaring (ikke-offentliggjorte data) mus, der blev holdt bedøvet kontinuerligt ved hjælp af inhaleret isofluran mellem 0 og 6 timers tid-punkt viste ubetydelig clearance. Ligeledes er en kontrolleret dosis bedøvelse også nødvendig for at sikre hurtig genopretning. Ved fastgørelse af dyret til pallen til billeddannelse bør fantomrøret, der bruges til medregistrering, holdes lavt på maven for at undgå, at artefakter overlapper lungerne. På samme måde skal du sørge for at fjerne metalmærker fra musen for at undgå artefakter fra røntgenspredning for at sikre et CT-billede af høj kvalitet.
Den nuværende MCC-protokol kan anvendes på utallige dyremodeller. Denne teknik har en ubetydelig effekt på dyrets sundhed scannet, tolereres godt af mus, og på grund af dette kan den bruges med sygdomsmodeller uden at risikere sundheden for allerede sarte mus. Styrken af denne metode kommer fra, at det er en in vivo-teknik, som giver mulighed for erhvervelse af konsekvente og repeterbare målinger af luftvejsfunktion uden at ofre dyr til punktafgiftsflyve for videomikroskopi, at ex vivo-modeller kræver26. Konsekvensen af denne teknik i produktionen af repeterbare målinger på tværs af flere scanninger af de samme dyr gør det muligt at behandle det samme dyr med forskellige agenser eller potentielle behandlingsstoffer, og statistiske sammenligninger foretaget mellem det samme dyr for at reducere biologisk variation, der er forbundet med enhver dyremodel, og derved reducere den prøvestørrelse, der er nødvendig for at vise statistisk signifikante forskelle.
Vurderingen af luftvejsfunktionen ved hjælp af MCC-teknikken kan justeres til en række dyremodeller og anvendes på mange forskellige modeller af luftvejssundhed samt test af nye behandlinger. Luftvejene af musemodeller af PCD kan vurderes ved hjælp af denne teknik samt modeller af KOL. Vores metode kan også bruges til at studere differentialvirkninger af forskellige bedøvelsesmidler på MCC, der er i almindelig klinisk brug. Endelig kan virkningerne af terapeutiske midler på luftvejene også vurderes ved hjælp af denne model. Som tidligere nævnt, men bærer gentagelse, da det er en in vivo måling det giver mulighed for gentagne MCC vurderinger i løbet af en sygdom, samt test fordele af terapeutiske indgreb over tid. Derudover er mus de mest almindelige forsøgsdyr, der bruges til at efterligne / studere menneskelige sygdomme, med i nogle tilfælde flere transgene musemodeller af menneskelig sygdom, der kan vælges fra.
The authors have nothing to disclose.
M.Z. og K.S.F. og dette arbejde blev støttet af et tilskud tildelt under Pitt Innovation Challenge (PInCh), gennem Clinical and Translational Science Institute ved University of Pittsburgh, og NHLBI R01 tilskud HL153407, tildelt M.Z.
500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire | Edmund Optics | 02-532 | |
99mTechnecium-Sulfur Colloid | Cardinal Health | ||
Anesthesia Vaporizer | Vetland Medical | A13480 | |
Durmont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software | |||
Introcan Safety Catheters 20G 1inch | Fisher Scientific | NC1534477 | |
Isoflurane | Henry Schein | 118-2097 | |
Mouse Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MSE-01 | |
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT | Siemens | ||
Single Channel Anesthesia Stand | Summit Anesthesia Solutions | 22860 |