Alternativ nedsænkning i glukose til at producere langvarig hyperglykæmi hos zebrafisk
Summary
Denne protokol fremkalder ikke-invasivt hyperglykæmi hos zebrafisk i op til 8 uger. Ved hjælp af denne protokol kan der foretages en dybdegående undersøgelse af de negative virkninger af hyperglykæmi.
Abstract
Zebrafisk (Danio rerio) er en fremragende model til at undersøge virkningerne af kronisk hyperglykæmi, et kendetegn for type II Diabetes Mellitus (T2DM). Denne alternative nedsænkningsprotokol er en ikke-invasiv, trinvis metode til at fremkalde hyperglykæmi i op til otte uger. Voksne zebrafisk udsættes skiftevis for sukker (glukose) og vand i 24 timer hver. Zebrafisken begynder behandling i en 1% glukoseopløsning i 2 uger, derefter en 2% opløsning i 2 uger og endelig en 3% opløsning i de resterende 4 uger. Sammenlignet med vandbehandlede (stress) og mannitolbehandlede (osmotiske) kontroller har glukosebehandlede zebrafisk betydeligt højere blodsukkerniveauer. Den glukosebehandlede zebrafisk viser blodsukkerniveauer på 3 gange så høje som kontroller, hvilket tyder på, at der efter både fire og otte uger kan opnås hyperglykæmi. Vedvarende hyperglykæmi var forbundet med øget Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) og øget nuklear faktor Kappa B (NF-kB) niveauer i nethinden og nedsat fysiologiske reaktioner, samt kognitive underskud tyder på denne protokol kan bruges til at modellere sygdom komplikationer.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er hurtigt ved at blive en udbredt dyremodel til at studere både sygdom og kognition1. Den lette genmanipulation og embryonale gennemsigtighed gennem de tidlige udviklingsstadier gør dem til en oplagt kandidat til at studere menneskelige sygdomme med et kendt genetisk grundlag. For eksempel har zebrafisk været brugt til at studere Holt-Oram syndrom, kardiomyopatier, glomerulocystic nyresygdom, muskeldystrofi, og diabetes mellitus (DM) blandt andre sygdomme1. Derudover er zebrafiskmodellen ideel på grund af artens lille størrelse, let vedligeholdelse og høj fecundity2,3.
Zebrafisk bugspytkirtlen er både anatomisk og funktionelt ligner pattedyr bugspytkirtel4. Således gør de unikke egenskaber ved størrelse, høj fecundity og lignende endokrine strukturer zebrafisk til en egnet kandidat til at studere DM-relaterede komplikationer. I zebrafisk er der to eksperimentelle metoder, der bruges til at fremkalde den langvarige hyperglykæmi, der er karakteristisk for DM: en tilstrømning af glukose (modellering type 2) og ophør af insulinsekretion (modellering type 1)5,6. Eksperimentelt, for at stoppe insulin sekretion, pancreas β-celler kan kemisk ødelægges ved hjælp af enten Streptozotocin (STZ) eller Alloxan injektioner. STZ er blevet brugt med succes i gnavere og zebrafisk, hvilket resulterer i komplikationer forbundet med retinopati7,8,9, kognitive svækkelser10og lemmer regenerering11. Men i zebrafisk regenererer β celler efter behandling, hvilket forårsager ,at “booster injektioner” af STZ er nødvendige for at opretholde diabetiske tilstande12. Alternativt kan bugspytkirtlen af zebrafisk fjernes6. Disse er begge meget invasive procedurer, på grund af de mange injektioner, og omfattende restitutionstid.
Omvendt kan hyperglykæmi induceres noninvasively gennem eksponering for eksogen glukose. I denne protokol nedsænkes fisk i en stærkt koncentreret glukoseopløsning i 24 timer5,13 eller kontinuerligt i 2 uger14,15,16. Eksogen glukose tages op transdermally, ved indtagelse, og / eller på tværs af gællerne resulterer i forhøjet blodsukker. Da denne ikke-invasive teknik ikke direkte manipulerer insulinniveauer, kan den ikke hævde at fremkalde type 2 DM. Det kan dog bruges til at undersøge komplikationer forårsaget af hyperglykæmi, som er et af de vigtigste symptomer på type 2 DM.
For nylig blev zebrafisk mutant pdx1-/- udviklet ved at manipulere bugspytkirtlen og duodenal homeobox 1-genet, et gen knyttet til den genetiske årsag til type 2 DM hos mennesker. Ved hjælp af denne mutant, forskere har været i stand til at kopiere bugspytkirtel udvikling forstyrrelser, højt blodsukker, og undersøgelse hyperglykæmi-induceret diabetisk retinopati17,18.
I dette papir beskriver vi en ikke-invasiv hyperglykæmiinduktionsmetode, der bruger en skiftende nedsænkningsprotokol. Denne protokol opretholder hyperglykæmiske tilstande i op til 8 uger med efterfølgende observerede komplikationer. Kort sagt placeres voksne zebrafisk i en sukkeropløsning i 24 timer og derefter en vandopløsning i 24 timer. I modsætning til kontinuerlig nedsænkning i eksterne glukoseopløsninger efterligner vekslende dage mellem sukker og vand stigningen og faldet af blodsukker i diabetes. En vekslende glukoseprotokol gør det desuden muligt at inducere hyperglykæmi i længere tid, da zebrafisken ikke er så i stand til at kompensere for de høje eksterne glukoseforhold. Som bevis for princippet leverer vi data, der viser, at hyperglykæmi induceret ved hjælp af denne protokol ændrer nethindekemi og fysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diabetes er et landsdækkende problem. Undersøgelser viser, at i 2030, en anslået 400 millioner mennesker vil have en form for diabetes. I gnavermodeller undersøges type 2 DM ved hjælp af genmanipulation. Hos rotter giver Zucker diabetiske fede rotter (ZDF) og Otsuka Long-Evans Tokushima fede rotter (OLETF) flere oplysninger om virkningerne af type 2 DM10. Derudover er højt fedtindhold kostvaner blevet brugt i gnaver til at fremkalde hyperglykæmi. Dette afspejler den ikke-invasive procedure,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende VPC, CJR og MCP for udviklingen af denne protokol. EMM modtog økonomisk støtte fra American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support til at udføre denne forskning. Dette arbejde blev også støttet af en American University Faculty Mellon Award og finansiering gennem American University College of Arts and Sciences (begge til VPC).
Materials
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
References
- Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
- Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. BioMed Research International. , (2012).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).
- Etuk, E. U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).
- Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes. Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).
- Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability. Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).
- Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).
- Biessels, G. J., Gispen, W. H. The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models. Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).
- Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory. Journal of Visualized Experiments. (72), e50232 (2013).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory. Research on Diabetes. , (2013).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5′-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio). Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).
- Ali, Z., et al. Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43 (2020).
- Wiggenhauser, L. M., et al. Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants. Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).
- Chen, X. L., et al. Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition. Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).
- Costa, E., et al. Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes. American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).
- Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).
- Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy. Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).
- Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes. Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).
- Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).
- Lieth, E., et al. Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 815-820 (1998).
- Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).
- Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).
- Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 445-449 (1998).
- Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Hancock, H. A., Kraft, T. W. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).
- Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat. Graefe’s Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).
- Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations. Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).
- Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).
- Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).
