यहां हम डीएनए-प्रोग्राम किए गए आसंजन का उपयोग करके एकल-कोशिका संकल्प पर माइक्रोपैटर्न कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक ग्लास स्लाइड पर डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के पैटर्न बनाने के लिए एक बेंचटॉप फोटोलिथोग्राफी प्लेटफॉर्म का उपयोग करता है और फिर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ सेल झिल्ली को लेबल करता है। ओलिगोस के संकरण के परिणामस्वरूप प्रोग्राम किए गए कोशिका आसंजन होतेहैं ।
कोशिकाओं की सापेक्ष स्थिति माइक्रोएनवायरमेंट की एक प्रमुख विशेषता है जो सेल-सेल इंटरैक्शन का आयोजन करती है। एक ही या विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, माइक्रोपैटर्निंग तकनीक उपयोगी साबित हुई है। कोशिकाओं की डीएनए प्रोग्रामेड असेंबली (डीपीएसी) एक माइक्रोपैटर्निंग तकनीक है जो डीएनए संकरण का उपयोग करके कोशिकाओं के आसंजन को सब्सट्रेट या अन्य कोशिकाओं में लक्षित करती है। डीपीएसी में सबसे बुनियादी संचालन लिपिड-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ सेल झिल्ली को सजाने के साथ शुरू होता है, फिर उन्हें एक सब्सट्रेट पर बहता है जिसे पूरक डीएनए दृश्यों के साथ पैटर्न किया गया है। कोशिकाएं चुनिंदा रूप से सब्सट्रेट का पालन करती हैं जहां उन्हें एक पूरक डीएनए अनुक्रम मिलता है। गैर-अनुयायी कोशिकाओं को धोया जाता है, जो अनुयायी कोशिकाओं के पैटर्न का खुलासा करते हैं। अतिरिक्त संचालन में सेल-सब्सट्रेट या सेल-सेल आसंजन के आगे के दौर शामिल हैं, साथ ही डीपीएसी द्वारा बनाए गए पैटर्न को दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एम्बेडिंग हाइड्रोगेल में स्थानांतरित करना शामिल है। इससे पहले, सतहों पर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड पैटर्निंग के तरीकों और डीएनए दृश्यों के साथ सजाने वाली कोशिकाओं को क्रमशः विशेष उपकरण और कस्टम डीएनए संश्लेषण की आवश्यकता होती है। हम प्रोटोकॉल के एक अद्यतन संस्करण की रिपोर्ट करते हैं, एक मॉड्यूलर प्रारूप का उपयोग करके तैनात एक सस्ती बेंचटॉप फोटोलिथोग्राफी सेटअप और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेस्ट्रॉल संशोधित ओलिगोनॉलियोटाइड्स (सीएमओ) का उपयोग करते हैं। सीएमओ लेबल कोशिकाएं डीएनए-पैटर्न वाले सब्सट्रेट्स के लिए उच्च दक्षता का पालन करती हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग उच्च परिशुद्धता के साथ एक बार में कई सेल प्रकारों को पैटर्न करने और एक बाह्य मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड माइक्रोटिस्यूस की सरणी बनाने के लिए किया जा सकता है। इस विधि के फायदे में इसका उच्च संकल्प, कोशिकाओं को माइक्रोपैटर्न को बाधित किए बिना त्रि-आयामी माइक्रोएनवायरमेंट में एम्बेड करने की क्षमता और किसी भी कोशिका प्रकार को पैटर्न करने में लचीलापन शामिल है।
ऊतक में एक – दूसरे के संबंध में कोशिकाओं की स्थिति माइक्रोएनवायरमेंट 1 , 2 ,3,4की एक महत्वपूर्ण विशेषता है । जीवित कोशिकाओं को स्थानिक रूप से नियंत्रित व्यवस्थाओं में पैटर्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकें भेदभाव4,5,6,7,8,सेल मोटिविटी9,मॉर्मोजेनेसिस10,11,12,मेटाबॉलिज्म13,और सेल-सेल इंटरैक्शन7,14 का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरणहैं। . कोशिकाओं को पैटर्न करने के लिए विभिन्न प्रकार के तरीके मौजूद हैं, प्रत्येक अपने स्वयं के फायदे और कमियां3,4के साथ। एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के चिपकने वाले द्वीप बनाने वाले तरीके, जैसे माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग और लेजर-कट स्टेंसिल, सरल और स्केलेबल हैं। हालांकि , एक समय में एक या दो से अधिक कोशिका प्रकारों को पैटर्न करना मुश्किल होता है क्योंकि विभिन्न ईसीएम अणुओं के लिए विभिन्न कोशिका प्रकारों के चिपकने वाले गुण अक्सर15 , 16,17समान होते हैं । अधिक जटिल माइक्रोपैटर्न प्रकाश-प्रेरित आणविक सोखने (लिम्प) के साथ बनाया जा सकता है, एक तकनीक जो खूंटी-लेपित क्षेत्रों को अवशोषित करने के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करती है और बाद में प्रोटीन सोखने के लिए अनुमति देती है18,19। इस प्रक्रिया को कई सेल प्रकारों के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोपैटर्न बनाने के लिए दोहराया जा सकता है। हालांकि, विभिन्न प्रोटीन पैच के लिए कोशिकाओं के क्रॉस-बाइंडिंग हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप खराब पैटर्न विशिष्टता19होती है। माइक्रोमैकेनिकल रीकॉन्फिगरेबल कल्चर उपकरणों पर कोशिकाओं को सीडिंग करने जैसे भौतिक तरीके गतिशील नियंत्रण के साथ संरचित सह-संस्कृतियों का निर्माण कर सकते हैं, लेकिन माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग या लिम्प14,8के पैटर्न डिजाइन में लचीलेपन के बिना। अन्य तकनीकों के विपरीत, बायोप्रिंटिंगहाइड्रोगेल 20, 21के भीतर कोशिकाओं की त्रि-आयामी व्यवस्था बनासकताहै। हालांकि, बायोप्रिंटेड स्ट्रक्स्ट्रेशन में अन्य माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों की तुलना में बहुत कम रिज़ॉल्यूशन होता है, जिसमें सैकड़ों माइक्रोन22के क्रम पर औसत फीचर आकार होता है। एक आदर्श सेल पैटर्निंग विधि में उच्च संकल्प, पैटर्न मल्टीपल सेल प्रकार, उपकरण और रिएजेंट का उपयोग करना होगा जो आसानी से सुलभ हैं, और तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति के लिए एक हाइड्रोगेल में सफल पैटर्न को एम्बेड करने की क्षमता रखते हैं। इस लेख में, हम सीएमओ-डीपीएसी, एक सेल माइक्रोपैटर्निंग तकनीक पेश करते हैं जो एक सब्सट्रेट के लिए सेल आसंजन को लक्षित करने के लिए डीएनए संकरण के लचीलेपन और गति का उपयोग करता है। इस विधि को अधिक किफायती, मॉड्यूलर और सुलभ बनाने के लिए हमारे पिछले प्रोटोकॉल23,24 से अनुकूलित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके, किसी भी प्रयोगशाला को किसी भी विशेष उपकरण या विशेषज्ञता के बिना पूरी तरह से कार्यात्मक प्रणाली स्थापित करने में सक्षम होना चाहिए।
कोशिकाओं की डीएनए प्रोग्राम असेंबली (डीपीएसी) एक शक्तिशाली ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक है जो कोशिका-कोशिका अंतर और ऊतक ज्यामिति पर सटीक नियंत्रण के साथ एकल-कोशिका संकल्प पर कोशिकाओं को पैटर्न करती है। डीपीएसी में, कोशिका झिल्ली को कोशिका झिल्ली पर संकरित करने के लिए डिज़ाइन किए गए दो लिपिड-संशोधित ओलिगोस का उपयोग करके डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (ओलिगोस) से सजाया जाता है। क्योंकि ओलिगोस हाइड्रोफोबिक लिपिड के लिए संयुग्मित होते हैं, वे तेजी से कोशिका झिल्ली25 में विभाजित होते हैं जहां वे संकरण करते हैं, गैर-सहसंबद्ध अणुओं की शुद्ध हाइड्रोफोबसिटी में वृद्धि करते हैं, और इस तरह सेल सतह26पर अपने जीवनकाल को बढ़ाते हैं। ओलिगोस को सेल की सतह पर इस तरीके से प्रस्तुत किया जाता है जहां वे निर्धारित संरचना, सेल-सेल अंतर औरज्यामिति23,24के साथ परिभाषित 2D या 3 डी सेल पैटर्न बनाने के लिए अन्य कोशिकाओं या डीएनए-कार्यात्मक ग्लास स्लाइड पर पूरक ओलिगोस के साथ संकरण कर सकते हैं। पैटर्न वाले माइक्रोटिस्यूज़ को सतह से एंजाइमेटिक रूप से बंद किया जा सकता है और लंबे समय तक 3 डी संस्कृति के लिए हाइड्रोगेल में एम्बेडेड किया जा सकता है। प्राथमिक कोशिकाओं या स्टेम कोशिकाओं के संयोजन में उपयोग किए जाने पर, कोशिकाओं के परिणामस्वरूप संग्रह मॉर्फोजेनेसिस से गुजर सकते हैं औरऑर्गेनॉइड 23,27, 28में बनसकतेहैं। DPAC को प्रतिस्पर्धी संकेतों6, 29के जवाब में वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल भाग्य की गतिशीलता की जांच करने के लिए लागू किया गया है, जो23, 28, 28के स्तन एपीथेलियल कोशिकाओं के स्व-संगठन का अध्ययन करने के लिए और मेसेंचिमल संघनन27के माध्यम से “ऊतक ओरिगेमी” उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया है।
DPAC कई सेल आबादी के सटीक प्लेसमेंट के लिए अनुमति देता है और एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर (माइक्रोन के आदेश पर)22, 23की तुलना में काफी बेहतर संकल्प है। इसके अलावा, माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग जैसे ईसीएम-आधारित पैटर्निंग विधियों के विपरीत, डीपीएसी को ईसीएम-लेपित सतह15,23में विभिन्न सेल प्रकारों के अंतर आसंजन की आवश्यकता नहीं होती है। यह इस बारे में सवालों के जवाब देने के लिए आदर्श है कि ऊतक की संरचना उसके व्यवहार को कैसे प्रभावित करती है, कैसे कोशिकाएं निर्णय लेते समय कई सेलुलर और माइक्रोएनवायरमेंटल संकेतों को एकीकृत करती हैं6,29,और कोशिकाओं के जोड़े एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं। अन्य माइक्रोपैटरिंग विधियों पर इस विधि का एक लाभ यह है कि इसका उपयोग एक इमेजिंग विमान में 3 डी सेल संस्कृति के लिए किया जा सकता है, जिससे ऊतक स्व-संगठन और ऑर्गेनॉइड मॉर्फोजेनेसिस23,27,30के समय-चूक अध्ययनों को सुविधाजनक बनाया जा सकता है।
इन फायदों के बावजूद, डीपीएसी के सफल कार्यान्वयन के लिए कस्टम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड रिएजेंट्स के संश्लेषण और डीएनए पैटर्निंग23,24के लिए विशेष उपकरणों तक पहुंचकीआवश्यकता है, जो व्यापक गोद लेने को सीमित करता है। उदाहरण के लिए, मूल प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले इष्टतम लिपिड-संशोधित ओलिगोस (एलएमओ) को कस्टम संश्लेषित किया जाना चाहिए, जो लिग्नोस्रिक एसिड या पामिटिक एसिड के साथ संशोधित किया जाना चाहिए, औरशुद्ध 26होना चाहिए। इस प्रक्रिया में डीएनए सिंथेसाइज़र और एक उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी उपकरण के उपयोग के साथ-साथ मिथाइलामाइन जैसे संबद्ध अभिकर्णों की खरीद की आवश्यकता होती है, जो एक नियंत्रित पदार्थ है जो संस्थागत और संघीय दोनों नियमों के अधीन है। एक विकल्प के रूप में, एलएमओ थोक में खरीदा कस्टम किया जा सकता है, लेकिन यह प्रौद्योगिकी में एक महत्वपूर्ण अप-फ्रंट निवेश की आवश्यकता है ।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने डीपीएसी का एक संशोधित संस्करण विकसित किया है जो कस्टम-संश्लेषित एलएमओ के स्थान पर वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध कोलेस्ट्रॉल-संशोधित ओलिगोस (सीएमओ) का उपयोग करता है। लागत को और कम करने और मंच के लचीलेपन को बढ़ाने के लिए, हम एक मॉड्यूलर, तीन ओलिगो प्रणाली में बदल गए हैं । प्रत्येक अद्वितीय सेल आबादी के लिए एक नए कोलेस्ट्रॉल-संशोधित ओलिगो का आदेश देने के बजाय, इस प्रोटोकॉल का एक उपयोगकर्ता हर कोशिका आबादी के लिए एक ही कोलेस्ट्रॉल-संशोधित ओलिगो (“यूनिवर्सल एंकर” और “यूनिवर्सल को-एंकर”) का उपयोग कर सकता है और फिर एक सस्ती, असंशोधित ओलिगो (“एडाप्टर स्ट्रैंड”) को रोजगार देता है जो सार्वभौमिक एंकर और या तो सतह या किसी अन्य सेल प्रकार के एडाप्टर स्ट्रैंड पर समान डीएनए दोनों के साथ संकरित करता है।
मूल डीपीएसी प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह थी कि इसने उच्च-रिज़ॉल्यूशन तरल प्रिंटर (जैसे, नैनो ईनबलर, बायोफोर्स नैनोसाइंसेज)23, 24का उपयोग करके डीएनए-पैटर्न वाली स्लाइड बनाई। हालांकि यह उपकरण असाधारण संकल्प और कम रिएजेंट आवश्यकताओं को समेटे हुए है, यह अधिकांश संस्थानों के लिए उपलब्ध नहीं है और इसमें अपेक्षाकृत कम मुद्रण दर (लगभग 1 सुविधा प्रति सेकंड पैटर्न) है। हाल ही में, सतहों पर डीएनए सुविधाओं को पैटर्न करने के लिए दो फोटोलिथोग्राफिक तरीके विकसित किए गए हैं। वायोला और उनके सहयोगियों ने एक पॉलीएक्रीलामाइड और बेंजोफेनोन कोटिंग का उपयोग किया जो यूवी लाइट30के संपर्क में आने पर एकल-फंसे डीएनए ओलिगोस को सहसंबद्ध करता था। इस विधि का उपयोग करके, वे ऊतक मचान बनाने में सक्षम थे जो सेल संकुचन और आत्म-संगठन के परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर, प्रोग्राम किए गए आकार में परिवर्तन करते थे। Scheideler एट अल एक विधि है कि एक सकारात्मक फोटोरेसिस्ट के यूवी जोखिम का उपयोग करता है चुनिंदा एक एल्डिहाइड-कार्यात्मक स्लाइड29के लिए अमीन संशोधित डीएनए ओलिगोस का पर्दाफाश विकसित की है । बेकिंग और अपचय के बाद, अमीन-संशोधित डीएनए को सतह पर सहसंयोजक रूप से बांधा जाता है। इस विधि का उपयोग वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए किया गया था ताकि स्व-नवीकरण और भेदभाव संकेत प्रस्तुत किए जा सके। यह लेख डीएनए पैटर्न बनाने के लिए Scheideler एट अल के प्रोटोकॉल को अनुकूलित करता है जो सीएमओ-लेबल कोशिकाओं को कैप्चर करेगा। यह फोटोपैटर्निंग प्रोटोकॉल एक साफ कमरे का उपयोग किए बिना किया जा सकता है। यह सस्ती और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है जो आसानी से बेंचटॉप या धूम हुड पर तैनात किया जाता है। सस्ती या DIY (यह अपने आप को) फोटोलिथोग्राफी उपकरण का उपयोग साफ कमरे की सुविधाओं के लिए उपयोग के बिना शोधकर्ताओं तक पहुंच बढ़ जाती है और शोधकर्ताओं को समय या संसाधनों का एक बड़ा निवेश के बिना तकनीक की कोशिश करने की अनुमति देता है31,३२। हालांकि, बेहतर संकल्प और कई डीएनए सुविधाओं के संरेखण को आमतौर पर क्लीनरूम सुविधाओं में पाए जाने वाले वाणिज्यिक स्पिन कोटर और मास्क एलाइनर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।
यहां, हम डीएनए-आधारित आसंजन का उपयोग करके एकल-कोशिका संकल्प पर कोशिकाओं को पैटर्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, एक सकारात्मक फोटोरेसिस्ट के साथ फोटोपेटर्निंग का उपयोग एल्डिहाइड-संशोधित ग्लास सब्सट्रेट पर अमीन-संशोधित डीएनए के उच्च-संकल्प पैटर्न बनाने के लिए किया जाता है। इसके बाद, गैर-विशिष्ट सेल अटैचमेंट को कम करने के लिए स्लाइड का इलाज किया जाता है और नमूनों वाले क्षेत्रों में कोशिकाओं को सीमित करने के लिए पीडीएमएस प्रवाह कोशिकाएं बनाई जाती हैं । कोशिकाओं को तब छोटे डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ लेबल किया जाता है जो कोलेस्ट्रॉल के साथ कार्यात्मक होते हैं और परिणामस्वरूप कोशिका झिल्ली में सम्मिलित होते हैं। इसके बाद कोशिकाओं को डीएनए माइक्रोपैटर्न के ऊपर प्रवाहित किया जाता है । कोशिका-सतह डीएनए और कांच की सतह पर डीएनए के बीच संकरण डीएनए पैटर्न के लिए कोशिकाओं के विशिष्ट आसंजन में परिणाम है । गैर-अनुयायी कोशिकाओं को धोया जाता है, जो अनुयायी कोशिका पैटर्न का खुलासा करते हैं। इस प्रक्रिया को कई सेल प्रकारों के पैटर्न या बहुस्तरीय संरचनाओं को बनाने के लिए दोहराया जा सकता है। यदि वांछित है, तो कोशिकाओं को पूरी तरह से 3 डी सेल संस्कृति के लिए ईसीएम में एम्बेडेड किया जा सकता है।
इस लेख में, हम इन विट्रो सेल कल्चर प्रयोगों के लिए 2डी और 3डी में कोशिकाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन पैटर्निंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस विधि के पहले प्रकाशित संस्करणों के विपरीत, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपयोगिता पर केंद्रित है: इसके लिए अत्यधिक विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और सभी अभिकर्षकों को कस्टम संश्लेषण की आवश्यकता के बजाय विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है। अन्य सेल माइक्रोपैटर्निंग विधियों के विपरीत, यह विधि तेजी से और सेल-प्रकार नास्तिक है: इसके लिए एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन15के लिए विशिष्ट आसंजन की आवश्यकता नहीं है। सीएमओ-डीपीएसी द्वारा पैटर्न वाली कोशिकाओं को एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स जैसे मैट्रिक्स जैसे मैट्रिक्स या कोलेजन के भीतर एम्बेडेड किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप 3 डी संस्कृतियों में बहुत अधिक स्थानिक संकल्प के साथ वर्तमान में एक्सट्रूज़न प्रिंटिंग-आधारित विधियों22के साथ संभव है। सीएमओ-डीपीएसी का उपयोग प्रति स्लाइड सैकड़ों से हजारों सूक्ष्म सुविधाओं को बनाने के लिए किया जा सकता है, जिससे एक ही समय में कई प्रतिकृति का प्रदर्शन किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल की सफलता में सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक पैटर्न स्लाइड के शीर्ष पर प्रवाह कोशिकाओं में जोड़ा कोशिकाओं का घनत्व है। आदर्श रूप में, घनत्व कम से कम 25 मिलियन कोशिकाओं/एमएल होना चाहिए। जब प्रवाह कोशिकाओं में लोड किया जाता है, तो कोशिकाओं के इस घनत्व के परिणामस्वरूप पैटर्न(पूरक चित्रा 2B)के ऊपर कोशिकाओं की लगभग करीब-करीब पैक मोनोलेयर होती है। ये उच्च कोशिका घनत्व इस संभावना को अधिकतम करते हैं कि एक कोशिका सीधे डीएनए स्थान के शीर्ष पर बस जाएगी और पालन करेगी। सेल घनत्व को कम करने से समग्र पैटर्निंग दक्षता कम हो जाएगी। इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम सीएमओ समाधान जोड़ने से पहले पीबीएस या सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं को अच्छी तरह से निलंबित करना है। सीएमओ विभाजन बहुत तेजी से कोशिका झिल्ली में और सीएमओ समाधान को सीधे सेल पेलेट में जोड़ने से कोशिकाओं की विषम लेबलिंग होगी। सेल निलंबन के लिए सीएमओ समाधान जोड़ने के बाद, यह अच्छी तरह से पाइपिंग द्वारा मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि कोशिकाओं को समान रूप से सीएमओ के साथ लेबल किया जाता है। इन्क्यूबेशन के बाद, कई अपकेंद्रित्र के माध्यम से अतिरिक्त सीएमओ को अच्छी तरह से धोना और चरणों को धोना आवश्यक है। सेल निलंबन में मौजूद अतिरिक्त मुक्त सीएमओ कांच की स्लाइड पर पैटर्न वाले अमीन-संशोधित डीएनए से बांधेंगे, निलंबन में सीएमओ-संशोधित कोशिकाओं के संकरण और आसंजन को अवरुद्ध करेंगे। इस प्रोटोकॉल के लिए समय भी एक महत्वपूर्ण विचार है । सीएमओ का उपयोग करते समय जितनी जल्दी हो सके काम करना और कोशिकाओं को बर्फ पर रखना महत्वपूर्ण है ताकि सीएमओ के आंतरिककरण को कम किया जा सके और सेल व्यवहार्यता को अधिकतम किया जा सके। फ्लो साइटोमेट्री प्रयोगों से पता चला है कि सीएमओ एलएमओ के रूप में सेल की सतह पर लंबे समय तक नहीं रहते हैं, जिसमें बर्फ३६पर दो घंटे से अधिक इनक्यूबेशन सीएमओ परिसरों का 25% नुकसान होता है । इसके अलावा, कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम हो जाएगी क्योंकि सेल हैंडलिंग समय बढ़ जाता है। व्यवहार्यता को जल्दी से काम करके, बर्फ पर कोशिकाओं को रखने, बर्फ-ठंडे अभिकर् ती का उपयोग करके, और कुछ पोषक तत्व प्रदान करने के लिए सीरम-मुक्त मीडिया का उपयोग करके अधिकतम किया जा सकता है।
हालांकि सीएमओ-DPAC उच्च परिशुद्धता के साथ कोशिकाओं पैटर्निंग द्वारा सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने का एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है, यह अपनी सीमाएं है । सीएमओ-डीपीएसी प्रयोग चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं, विशेष रूप से प्रयोगात्मक जटिलता को कई सेल प्रकारों, परतों, या 3 डी सेल संस्कृति(पूरक फ़ाइल 1)के साथ जोड़ा जाता है। इस प्रोटोकॉल को शुरू करते समय प्रयोगात्मक विफलताएं आम हो सकती हैं, जैसा कि तालिका 1में वर्णित है। इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि उपयोगकर्ता गुणवत्ता नियंत्रण जांच संस्थान (पुष्टि करते हैं कि डीएनए स्लाइड पर मौजूद है, इस बात की पुष्टि करता है कि कोशिकाओं को डीएनए (चरण 8) के साथ पर्याप्त रूप से लेबल किया गया है, यह पुष्टि करते हुए कि अतिरिक्त कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोया गया है, आदि) यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोग सफल होता है और उन चरणों की पहचान करने के लिए जिन्हें आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हमें उम्मीद है कि इस पांडुलिपि में दी गई जानकारी और इसकी पूरक फाइलों से किसी भी आवश्यक समस्या निवारण को सुगम बनाने में मदद मिलेगी।
कोलेस्ट्रॉल एक जैव सक्रिय अणु है जिसका आंतरिककरण कोशिका चयापचय, जीन अभिव्यक्ति और झिल्ली तरलता37, 38को प्रभावित कर सकता है। एक पिछले अध्ययन में सीएमओ और एलएमओ-लेबल कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति पर पड़ने वाले प्रभावों की तुलना एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करके की गई थी । सीएमओ लेबल एचईके कोशिकाओं ने अवेलेबल और एलएमओ लेबल वाली कोशिकाओं३६की तुलना में जीन अभिव्यक्ति को बदल दिया था । सीएमओ के साथ लेबलिंग कोशिकाओं के परिणामस्वरूप अवेलेबल नियंत्रणों के सापेक्ष आठ जीनों की अंतर अभिव्यक्ति (> 1.5 गुना) हुई, जिसमें एपी 2बी1 शामिल है, जिसे कोलेस्ट्रॉल और स्फिंगोलिपिड परिवहन (जेनकार्ड्स) और मालट1 से जोड़ा गया है, जो कोलेस्ट्रॉल संचय39को नियंत्रित करने वाला एक लंबा गैर-कोडिंग आरएनए है। जबकि मामूली, इन प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं फिर भी चिंता का विषय हो सकता है अगर प्रश्न में प्रयोग चयापचय, झिल्ली गतिशीलता, या कोशिकाओं में अंय कोलेस्ट्रॉल से जुड़े रास्ते का अध्ययन कर रहा है ।
यह प्रोटोकॉल लचीला है और प्रत्येक प्रयोग की जरूरतों को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। क्योंकि सीएमओ किसी भी विशिष्ट रिसेप्टर का उपयोग करने के बजाय लिपिड झिल्ली में खुद को सम्मिलित करता है, विधि सेल प्रकार नास्तिक है (एचयूवीसी, एमसीएफ 10ए, एचईके, और एमडीकेएस यहां प्रदर्शित किए गए हैं)। हालांकि कोलेस्ट्रॉल हमारे पहले प्रकाशित एलएमओ की तुलना में एक अलग हाइड्रोफोबिक लंगर है, हम इस प्रकार अब तक उन्हें इसी तरह व्यवहार करने के लिए पाया है। इस प्रकार, हम उम्मीद करेंगे कि सीएमओ एलएमओ के साथ पहले प्रकाशित किए गए किसी भी प्रकार के सेल प्रकारों के साथ काम करें, जिसमें तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं और प्राथमिक स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं6,23, 27,29,36 तक सीमित नहीं है। . सीएमओ लेबलिंग TLR9 को प्रोत्साहित नहीं करता है, सुझाव है कि प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ संगत है । सीएमओ का झिल्ली समावेश कुल कोशिका आकार का कार्य है और सेल ग्लाइकोकलिक्स35में नकारात्मक आवेश की डिग्री है। इस प्रकार, हमने झिल्ली निगमन की सीमा का परीक्षण करने के लिए एक प्रोटोकॉल (चरण 8) शामिल किया है जो तेजी से अनुकूलन के लिए उत्तरदायी है। प्रत्येक सेल पैटर्न की विशिष्ट विशेषताएं अनिवार्य रूप से प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर भिन्न होंगी (अधिक मार्गदर्शन के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। हालांकि डीएनए पैटर्निंग के लिए ऊपर वर्णित फोटोपेटर्निंग प्रोटोकॉल की सिफारिश की जाती है, लेकिन अमीन-डीएनए समाधान की बूंदों को सीमित करने की किसी भी विधि को काम करना चाहिए, जैसे कि उच्च-संकल्प ड्रॉपलेट प्रिंटर का उपयोग। पैटर्न रिज़ॉल्यूशन और न्यूनतम सुविधा रिक्ति उपयोग की गई विधि के आधार पर भिन्न होगी। इस प्रोटोकॉल के डीएनए-फोटोपैटर्निंग वर्गों को अन्य तरीकों के साथ जोड़ना भी सैद्धांतिक रूप से संभव है, जिनका उपयोग डीएनए के साथ कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया गया है, जैसे कि डीएनए के साथ डीएनए को अप्रासंगिक-व्यक्त जिंक उंगलियों40के लिए संकरित डीएनए के साथ, एनएचएस-संयुग्मित डीएनए41का उपयोग करके, और कोशिका की सतह पर अज़िडो सियालिक एसिड अवशेषों को फॉस्फिन-कॉन्जुगेट डीएनए42 के साथ प्रतिक्रिया करना . सीएमओ-डीपीएसी को विभिन्न प्रकार के प्रयोगों पर लागू किया जा सकता है जिनके लिए सेल-सेल अंतर पर तंग नियंत्रण की आवश्यकता होती है, जिसमें कोशिकाओं के जोड़े के बीच बातचीत का अध्ययन, “प्रेषक” कोशिकाओं से “रिसीवर” कोशिकाओं के संकेतों के हस्तांतरण को देखते हुए सह-संस्कृति प्रयोग, और स्टेम सेसियभेद6,29 पर पास के बाह्राशक संकेतों के प्रभाव की जांच शामिलहै। . इस विधि का उपयोग माइक्रोटिस्यूज बनाने के लिए भी किया जा सकता है जिसका उपयोग तीन आयामों में सेल माइग्रेशन का अध्ययन करने, ऊतकों में कोशिकाओं के आत्म-संगठन23,27और कोशिकाओं और ईसीएम27के बीच गतिशील परस्पर क्रिया के लिए किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को अपनी प्रयोगशालाओं में उच्च-रिज़ॉल्यूशन डीएनए-आधारित सेल पैटर्निंग के नए अनुप्रयोगों का पता लगाने के लिए एक सुलभ मंच प्रदान करेगा।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए जेरेमी गार्सिया और यूसीएसएफ बायोमेडिकल माइक्रो एंड नैनोटेक्नोलॉजी कोर में उपकरणों पर प्रशिक्षण प्रदान करने के लिए भूषण खार्बिकर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस शोध के हिस्से में रक्षा स्तन कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम (W81XWH-10-1-1023 और W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA19315, DP2 HD080351-01, से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A, और 1R21CA182375-01A1), एनएसएफ (MCB1330864), और सेलुलर निर्माण के लिए UCSF केंद्र (DBI-1548297), एक NSF विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र । O.J.S. एक एनएसएफ ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप, एक सिबेल छात्रवृत्ति, और एक पीओ छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया गया था । जेडजेजी और ए.आर.ए. चान-जुकरबर्ग बायोहब जांचकर्ता हैं ।
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
Cell Culture Dishes 60×15 mm style | Corning | 353002 | |
Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |