3D-celletrykt hypoksisk kreft-på-en-chip for rekapitulerende patologisk progresjon av fast kreft
Summary
Hypoksi er et kjennetegn på tumormikromiljø og spiller en avgjørende rolle i kreftprogresjon. Denne artikkelen beskriver fabrikasjonsprosessen til en hypoksisk kreft-på-en-chip basert på 3D-celleutskriftsteknologi for å rekapitulere en hypoksirelatert patologi av kreft.
Abstract
Kreftmikromiljø har en betydelig innvirkning på sykdomsprogresjonen. Spesielt er hypoksi den viktigste driveren for kreftoverlevelse, invasjon og chemoresistance. Selv om flere in vitro-modeller er utviklet for å studere hypoksirelatert kreftpatologi, har det komplekse samspillet mellom kreftmikromiljøet observert in vivo ikke blitt reprodusert ennå på grunn av mangel på presis romlig kontroll. I stedet er det foreslått 3D biofabrikasjonsmetoder for å skape mikrofysiologiske systemer for bedre emulering av kreftøkologi og nøyaktig evaluering av anticancerbehandling. Her foreslår vi en 3D-celleutskriftsmetode for å fremstille en hypoksisk kreft-på-en-chip. De hypoksiinduserende komponentene i brikken ble bestemt basert på en datasimulering av oksygenfordelingen. Kreft-stroma konsentriske ringer ble trykt ved hjelp av bioinks som inneholder glioblastomceller og endotelceller for å rekapitulere en type solid kreft. Den resulterende brikken realiserte sentral hypoksi og forverret malignitet i kreft med dannelsen av representative patofysiologiske markører. Samlet sett forventes den foreslåtte tilnærmingen for å skape et solid-kreft-mimetisk mikrofysiologisk system å bygge bro mellom in vivo- og in vitro-modeller for kreftforskning.
Introduction
Kreftmikromiljøet er en kritisk faktor som driver kreftprogresjonen. Flere komponenter, inkludert biokjemiske, biofysiske og cellulære signaler, bestemmer de patologiske egenskapene til kreft. Blant disse er hypoksi sterkt forbundet med kreftoverlevelse, spredning og invasjon1. På grunn av ubegrenset vekst og oppdeling av kreftceller, blir næringsstoffer og oksygen kontinuerlig utarmet, og en hypoksisk gradient genereres. Under forhold med lavt oksygennivå aktiverer celler hypoksi-inducible transkripsjonsfaktor (HIF)-assosiert molekylær kaskade. Denne prosessen induserer en nekrotisk kjerne, utløser metabolske endringer og initierer blodkar hyperplasi og metastase2,3. Deretter forårsaker hypoksi i kreftceller ødeleggelsen av nærliggende normale vev. Videre er hypoksi sterkt forbundet med terapeutisk motstand av faste svulster i multifaktorielle manerer. Hypoksi kan sterkt hindre strålebehandling, da radiosensitiviteten er begrenset på grunn av reaktive oksygenarter1,4. I tillegg reduserer det pH-nivåer av kreftmikromiljøet, noe som reduserer legemiddelakkumulering1. Derfor er reproduserende patologiske egenskaper relatert til hypoksi in vitro en lovende strategi for vitenskapelige og prekliniske funn.
Modellering av et spesifikt mikromiljø av kreft er avgjørende for å forstå kreftutvikling og utforske passende behandlinger. Selv om dyremodeller har blitt mye brukt på grunn av deres sterke fysiologiske relevans, eksisterer problemer knyttet til artsforskjeller og etiske problemer5. Videre, selv om konvensjonelle 2D- og 3D-modeller tillater manipulering og sanntidsavbildning av kreftceller for en grundig analyse, kan deres arkitektoniske og cellulære kompleksitet ikke fullstendig rekapituleres. For eksempel har kreftsfæroidmodeller blitt mye brukt, da kreftcelleaggregering i en sfæroid kan naturlig generere hypoksi i kjernen. Videre er et stort antall cellulære sfæroider av jevn størrelse produsert ved hjelp av plast- eller silikonbaserte multibrønnsystemer6,7. Imidlertid har den lavere fleksibiliteten med hensyn til å fange den eksakte heterogene strukturen av kreftvev med konvensjonelle plattformer krevd etablering av en avansert biofabrication-teknologi for å bygge en svært biomimetisk plattform for å forbedrekreftforskningen 8.
3D mikrofysiologiske systemer (MPSs) er nyttige verktøy for å rekapitulere den komplekse geometrien og patologiske progresjonen av kreftceller9. Ettersom kreftceller registrerer den biokjemiske gradienten av vekstfaktorer og kjemokiner og den mekaniske heterogeniteten som reproduseres på systemet, kan viktige trekk ved kreftutvikling undersøkes in vitro. For eksempel har kreft levedyktighet, metastatisk malignitet og legemiddelresistens avhengig av de varierende oksygenkonsentrasjonene blitt studert ved hjelp av MPSs10,11. Til tross for nylige fremskritt, er generering av hypoksiske forhold til in vitro-modeller avhengig av komplekse fabrikasjonsprosedyrer, inkludert tilkobling med fysiske gasspumper. Derfor er det nødvendig med enkle og fleksible metoder for å bygge kreftspesifikke mikromiljø.
3D-celleutskriftsteknologi har fått betydelig oppmerksomhet på grunn av sin presise kontroll over det romlige arrangementet av biomaterialer for å rekapitulere innfødte biologiske arkitekturer12. Spesielt overvinner denne teknologien de eksisterende begrensningene til 3D-hypoksimodeller på grunn av sin høye kontrollerbarhet og gjennomførbarhet for å bygge de romlige egenskapene til kreftmikromiljøet. 3D-utskrift forenkler også dataassistert produksjon gjennom en lag-for-lag-prosess, og gir dermed en rask, nøyaktig og reproduserbar konstruksjon av komplekse geometrier for å etterligne faktiske vevsarkitekturer. I tillegg til fordelene ved eksisterende produksjonsstrategier for 3D MPSs, kan de patofysiologiske egenskapene til kreftprogresjon reproduseres ved å mønstre de biokjemiske, cellulære og biofysiske komponentene13,14.
Her presenterer vi en 3D-celleutskriftsstrategi for en hypoksisk kreft-på-en-chip for å rekapitulere heterogeniteten til en solid kreft (Figur 1)15. Fabrikasjonsparametrene ble bestemt via en beregningssimulering av sentral hypoksidannelse i systemet. Kreft-stroma konsentriske ringer ble trykt ved hjelp av kollagen bioinks som inneholder glioblastomceller og endotelceller for å etterligne patofysiologien til glioblastom, en type solid kreft. Dannelsen av en radial oksygengradient forverret kreft malignitet, noe som indikerer styrket aggressivitet. Videre angir vi fremtidige perspektiver for anvendelsen av brikken til pasientspesifikke prekliniske modeller. Den foreslåtte tilnærmingen for å skape et solid-kreft-mimetisk mikrofysiologisk system forventes å bygge bro mellom in vivo- og in vitro-modeller av kreft.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien beskriver vi fabrikasjonsprosessen til en hypoksisk kreft-på-en-chip basert på 3D-celleutskriftsteknologi. Dannelsen av den hypoksiske gradienten i den designede brikken ble spådd gjennom datasimuleringer. Miljøet som kan indusere en heterogen hypoksisk gradient ble reprodusert via en enkel strategi som kombinerer den 3D-trykte gassgjennomtrengelige barrieren og glassdekselet. De hypoksi-relaterte patologiske egenskapene til glioblastom, inkludert pseudopalisade og en liten populasjon av kreft stamcel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Kunnskapsdepartementet (nr. 2020R1A6A1A03047902 og NRF-2018H1A2A1062091) og Korea-regjeringen (MSIT) (Nei. NRF-2019R1C1C1009606 og NRF-2019R1A3A3005437).
Materials
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22×50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] – Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal – Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation | ||
References
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4 (2019).
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -. H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -. G., Lee, H., Cho, D. -. W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengineering. 4 (1), 10 (2017).
- Yi, H. -. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -. Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -. W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -. H., Lee, J. -. S., Kim, J. Y., Cho, D. -. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -. W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
