Summary
卵母細胞凍結保存は、思春期後の女性の不妊治療の保存のためのゴールドスタンダードとしていくつかの国際科学協会によって認識されています。適切な臨床および実験室戦略は、最大の有効性、効率、および不妊治療の安全性を保証します。
Abstract
女性の生殖能力を維持することは、患者の将来の生活の質をケアする多機能医療システムにおいて重要です。卵母細胞凍結保存は、思春期後の女性の不妊治療の健康維持のためのゴールドスタンダードとして、いくつかの国際科学協会によって認識されています, 医療と非医学的適応症の両方のために.主な医学的適応症は、腫瘍疾患、重度の子宮内膜症などの婦人科疾患、卵巣予備軍を損なう全身性疾患、早期閉経を伴う遺伝的状態である。本論文では、客観的およびエビデンスに基づくカウンセリングに関する推奨事項を概説することにより、不妊治療の臨床および実験室のワークアップ全体について説明する。さらに、それは処置の有効性に焦点を当て、卵巣予備軍を完全に利用し、最短時間で取り出される卵母細胞の数を最大化するための最も適切な戦略を記述する。卵巣予備軍の評価、理想的な刺激プロトコルの定義、卵母細胞の検索、脱分、およびガラス化の手順は、その有効性、効率、安全性を最大化するためのアプローチと共に詳述されている。
Introduction
ヒト卵母細胞の効率的な凍結保存プログラムの開発と実施は、生殖医学における重要なブレークスルーとなっています。最近の証拠によると、ガラス化は、低凍結に比べて統計的に高い生存率をもたらすため、血相II(MII)卵子を凍結保存するための最も効果的な戦略であり、患者集団(不妊患者または卵母細胞の寄付プログラム)1、2、3とは無関係に。卵母細胞ガラス化の顕著な成果は、米国生殖医学会(ASRM)および生殖補助技術協会(SART)の実践委員会を導き、この技術が思春期後の女性の選択的不妊治療保存に最も効果的であると発音しました。不妊治療の保存のための医学的適応症には、(i)放射線療法、細胞傷害性化学療法、内分泌療法(卵巣予備軍に有害な影響が母親の年齢および治療の種類および用量に関連する)などの治療7を必要とする自己免疫疾患が含まれる。(ii) 繰り返しまたは根治的な手術を必要とする卵巣疾患 (子宮内膜症など)8;(iii)遺伝的状態(例えば、X-壊れやすい)または早期卵巣不全。さらに、不妊治療の保存は、非医学的理由(社会的凍結とも呼ばれる)のために親の目的を達成していないすべての女性にとって貴重な選択肢となっています。
不妊治療の保存の適応症に関係なく、不妊治療の保存に関する主要な国際ガイドラインに従って、すべての患者は、彼らの健康の成功の可能性、コスト、リスク、および手順9、10、11、12、13の限界について知らされる適切なカウンセリングを受けるべきである。最も重要なことは、MII卵母細胞のコホートを活性化することは妊娠を保証しないが、必要に応じて体外受精(IVF)治療のために成功する可能性が高いことを明らかにすべきである14。この点に関して、卵母細胞ガラス化時の女性の年齢は、確かに、進行した母親の年齢(AMA;>35歳)が女性不妊症の主な原因である15の最も重要な制限因子である。卵巣予備軍の進行性の減少に加えて、AMAは代謝、エピジェネティック調節、細胞周期チェックポイント、および細分性分離17のような生理的経路の欠陥による卵母細胞能力の障害と関連している。したがって、卵の合理的な数は主に母親の年齢に依存する。36歳未満の女性では、少なくとも8-10 MII卵母細胞18が成功の可能性を最大化する必要があります。一般に、ガラス化卵母細胞の数が多いほど、成功の可能性は高くなります。したがって、抗ミュレリアンホルモン(AMH)レベルまたはアントラル卵胞数(AFC)などの卵巣予備マーカーに従って卵巣刺激を調整することは、可能な限り短時間で卵巣予備を完全に利用するために重要である。
全体の手順の安全性は、不妊治療の保存のために患者を登録する際のもう一つの重要な問題です。臨床医は、リスクを最小限に抑え、(i)卵巣過剰刺激ホルモン(OHSS)などの安全なアプローチを使用してGnRHアゴニストトリガー19と(ii)リモートを防ぐために最善の戦略を採用する必要があります。 まだ可能, 腹膜出血のリスク, 骨盤構造への傷害 (尿管, 腸, 虫垂, 神経), 卵母細胞の検索中に骨盤感染.最後に、(iii)刺激のための伝統的なレジメンは、上端生理学的血清エストラジオールに関連付けられているため、乳癌などのエストロゲン感受性疾患では推奨されない。アロマターゼ阻害剤を含むプロトコル(レトロゾールまたはタモキシフェンなど)は、これらの場合20,21においてより適している。実験室での設定では、卵母細胞ガラス化のための最も広く普及したプロトコルは、クワヤマと同僚2、23によって最初に記述されたものであり、これは凍結保護剤(CPA)の段階的な添加を含む段階的な手順で構成されている。第1相(平衡/脱水)では、卵母細胞は7.5%v/vエチレングリコールおよび7.5%v/vジメチルスルホキシド(DMSO)を含むCPA溶液中に露出し、第2段階では卵母細胞を15%対/vエチレングリコールと15%v/v DMSO、プラス0.5糖質を含むガラス化溶液に移動する。ガラス化の媒体の短いインキュベーションの後、卵母細胞は、具体的に設計された開放性の凍結装置に配置することができ、最後に使用するまで保存される-196°Cで液体窒素に突っ込んだ。
ここでは、不妊治療の臨床および検査作業全体が(i)客観的およびエビデンスに基づくカウンセリングのための勧告を概説し、(ii)処置の費用対効果に焦点を当て、(iii)卵巣予備軍を完全に利用し、可能な限り短時間で取り出される卵母細胞の数を最大化するための最も適切な戦略を記述することによって説明された。卵巣予備軍の評価、理想的な刺激プロトコルの定義、卵母細胞の検索、脱潤、およびガラス化の手順は、その有効性、効率、安全性を最大化するためのアプローチと共に詳述される。このプロトコルの他のプロトコルまたは適応が文献に存在するので、この原稿の代表的な結果および議論のセクションはこの手順にのみ適用されます。
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Protocol
1. ワークアップと臨床カウンセリング
注:腫瘍学的な理由で不妊治療を必要とする患者の場合は、スケジューリング相談の待機リストがないことを確認し、できるだけ早く予約を行ってください。
- 病歴と以前の書類を調べ、患者の一般的な健康状態を評価します。
- すべての情報(がん患者の場合に卵巣刺激を受ける腫瘍学者の承認を含む)をリレーショナルデータベースに記録します。
- 患者に、処置の実現可能性に関する特定のカウンセリングを提供する。手順のステップ(卵巣刺激、卵母細胞の検索、卵母細胞のガラス化)を説明し、現実的な成功の可能性(主に母細胞の年齢と卵母細胞の検索時のMII卵母細胞の期待数に依存する)、ならびに手順のコストと限界について彼女に知らせる。
- 経膣超音波検査を行い、卵巣予備軍(すなわち、AFC)に関する情報を得て、卵子採取のための卵巣のアクセシビリティを評価する。
- 血液群および血球体因子、凝固スクリーニング(血球数、プロトロンビン、トロンボプラスチン、フィブリノーゲン、プロテインC、プロテインS、抗トロンビンIII、ホモシステイン)および感染症(B型肝炎、C型肝炎、HIV、静脈内疾患研究研究所/トレポネマ・パラダム・ヘマググルチネーション)を評価するための血液検査を要求する。
注:緊急でない医学的理由で不妊治療プログラムにアクセスする患者の場合、より包括的な評価には、基底卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、エストラジオール、AMH、乳房検査、パパニコラウ検査、凝固の遺伝子スクリーニング(ライデンおよびプロトロンビンの第V因子)、およびTORCHスクリーニング(トキソプラスイシスモス、ルメガロ)が含まれる可能性があります。 - 心学的評価(心電図)を要求する。
- 心理カウンセリングを勧めます。
2. 不妊治療の保存のための制御された卵巣刺激プロトコル
注:がん治療を開始するまでの時間が限られている場合、ランダム開始プロトコル(すなわち、月経周期中にいつでも卵巣刺激を開始する)は、不妊治療の候補である腫瘍学的患者の卵巣刺激に推奨される。緊急でない医療上の理由や社会的理由による不妊治療プログラムでは、早期濾胞期から始まる従来の刺激が好ましく、月経周期に基づいて卵巣刺激が開始される。制御された卵巣刺激(COS)アプローチは、最近の欧州生殖発生学会(ESHRE)ガイドライン24に従って行われるべきである。
- 患者の特性と卵巣予備マーカー、主に母体年齢、FSH、AMH、およびAFCに応じてCOSを調整します。
- 150-300 IU/日の固定用量(アンタゴニストプロトコル)の固定用量で組換えまたは尿FSHを使用して月経周期の5日目にCOSを開始します。
注:LH欠乏または不十分な最適でない応答を有する特定の患者集団において、追加のLH 75/150 IU/日は卵巣応答、LHレベル、および婦人科医の判断に従って投与され得る。 - エストロゲン感受性疾患の患者には、アロマターゼ阻害剤(レトロゾール)に関連するゴナドトロピンが1日目から卵母細胞の検索後7日目まで含まれる。
- 4日間、性腺刺激ホルモンの固定用量を投与する。
- 5日目に卵胞の成長を監視し、2〜3日ごとに;最終的に, ゴナドトロピンの投与量を調整します。.
- 少なくとも3つの卵胞が直径17〜18mmに達したら、0.5 mLの用量でGnRHアゴニストの単一の皮下ボーラスで最終的な卵母細胞成熟のトリガーを投与する。
3. 卵母細胞の検索
- 卵母細胞検索の準備
- 必要な材料については、 材料表を参照し、準備の実験室の履物や衣装、外科用フェイスマスク、ヘアカバー、外科用手袋、永久非毒性マーカー、ピンセット、無菌小さなガーゼ、使い捨てまたは再利用可能な分光器、膣外科装置および表面消毒剤を保管してください。蘇生装置、逆転用麻酔薬、アナフィラキシーショックの治療用に用意されたキット、および手術室の酸素の入手可能性を確保します。
- 補助再生技術(ART)25における超音波に関するESHREワーキンググループの勧告に従って卵母細胞検索手順を実行する。
- セデレーションまたは全身麻酔、および予防のための抗生物質を投与する。
注:このプロトコルでは、深い沈下はプロポフォール(患者の体重に応じて投与量が調整される)とフェンタニルの50〜100 μg、パラセタモールの1000mg、および酸素による補助マスク換気を管理することによって達成された。 - 真空ポンプ、17G単本管針に接続された回収管、および卵母細胞収集チューブで構成された吸引ユニットを使用して卵母細胞の検索を行います。収集中は、cumulus細胞の剥がれや透明帯の破砕などの卵母細胞への損傷のリスクを避けるために、〜120mmHgの圧力を超えないでください。
- 作業面温度を校正し、培養培地で37°Cを確保します。全体の手順の間に、彼らの発達能力に影響を与える可能性のある過渡温度への卵母細胞暴露を最小限に抑えます。
- 卵母細胞の検索の終わりに、退院前に患者を3〜4時間観察する。
- セデレーションまたは全身麻酔、および予防のための抗生物質を投与する。
- オペレーションシアター
- 手術室に入る前に、患者を特定し、排卵のトリガーの時間を確認します。
- 患者に婦人科の位置で手術台の上に横たわらずれさせよ。
- 卵母細胞の検索前に膣/子宮頸部を浄化し、細菌汚染を最小限に抑えます。
- 卵巣の位置と様々な器官および血管との解剖学的関係を評価するために予備経膣超音波を行う。
- 超音波指導の下で、膣壁を通って卵巣卵胞に単一の内腔針を挿入し、膣壁と卵巣の間に位置する器官または血管を傷つないように注意する。
- 最も近い卵胞から吸引を開始し、最も遠位のものに移動します。
- 直径11〜12mmより大きい直径のすべての卵胞を穿刺し、針の「ねじれた動き」を行い、濾胞液全体を吸引し、手術室のブロックヒーターで予熱した無菌チューブ(丸底14mL)に放出される。
- 検索直後に、患者の身元の詳細をチューブに密封してラベルを付けます。
- 看護師が実験室にチューブを持って来ることを確認し、そこですぐに積雲卵母細胞複合体(COC)の存在をスクリーニングします。
- 発生学者に、取得したCOCの総数を臨床医に知らせる。
- 最初の卵巣の手順が完了したら、きれいな媒体で針を洗い流し、同じ手順を使用して第2の卵巣を進める。
- 卵母細胞の検索後、ダグラスのパウチの卵巣または血管の血管および自由流体からの出血を評価する。
注: 臨床レベルでのテデおよび胚のトレーサビリティの有効性を自動化および改善するために、電子ミラーリング監視システム(EWS)がセンター26に実装されました。それにもかかわらず、このプロトコルは、任意のIVFの実験室でプロトコルの再現性を確保するために、EWSについては言及していない。それでも、手順のすべてのステップは、テゲテと胚のトレーサビリティを確保するために第二のオペレータ(すなわち証人)を必要とすることを考慮してください。
4. IVF研究室
- 卵母細胞の検索手順の前日
- 卵母細胞収集チューブを準備します( 材料表を参照)。
- 胚培養用の卵母細胞採取管(丸底、5 mL)に1mLのIVF培地( 材料表参照)を塗布し、0.2mLの鉱油( 材料表参照)で覆う。
注: チューブの数は、取得する予定の卵胞の数に従って定義されます。各チューブには最大 4 つの COC が含まれる場合があります。
- 胚培養用の卵母細胞採取管(丸底、5 mL)に1mLのIVF培地( 材料表参照)を塗布し、0.2mLの鉱油( 材料表参照)で覆う。
- キャップ(最初のスナップ)でチューブを密封します。培地の種類と準備日の詳細をチューブにラベル付けします。制御された雰囲気の中で37°Cで一晩チューブをインキュベートする(6%CO2、5%02)。
- 卵母細胞収集チューブを準備します( 材料表を参照)。
- 卵母細胞の検索の日に
- 37 °C(滅菌培養皿とパスツールピペット)でプラスチック供給を予熱します。
- 患者に身元(氏名と生年月日)と排卵の時期を確認してもらいます。検査シートに、ID(ID)の確認手順が完了していること、および排卵の時期が確認されていることを示します。
- 卵母細胞の採取管を(手順が始まる直前に)インキュベーターから取り出し、キャップを押し下げて密閉を確実にします。卵母細胞採取管に患者の情報をラベル付けします。37 °Cのブロックヒーターに卵母細胞のコレクションチューブを置きます。
- 前温めの無菌培養皿の濾胞液を調べ、COCsを同定する。1つ以上のCOCが特定されたら、2滴の培地で2回リンスして濾胞液と血液汚染を除去します。
- COCを卵子コレクションチューブに移し、チューブ上のCOCの数にコメントを付けます。培地チューブのキャップをゆるめ、6%CO2、5%O2の雰囲気の中で37°Cで速やかにインキュベートします。
- 取得した卵母細胞の数に応じて、手順 7 ~ 9 を繰り返します。実験室のシートを更新します。
注: すべてのチューブウォーミングブロック(手術室内のものを含む)が空であることを確認し、実験室のシート上の手順の終了に署名する証人であることを確認します。 - 手順の完了後に作業段階を拭き取ります。
5. 卵母細胞の否定
- プレウォーム4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジンタンスルホン酸(HEPES)緩衝培地およびヒアルロニダーゼ( 材料表参照)を開始する前に37°Cで開始する。
- 胚培養用の0.3mLの鉱油で覆われた0.6mL/ウェルの前温化HEPES緩衝培地(5%ヒト血清アルブミン[HSA]を補う)で4ウェルIVFプレート( 材料表参照)を準備し、少なくとも30分間37°Cで37°Cで温めます。
- 患者の身元の詳細を卵母細胞の樹状化プレートにラベル付けします。
- 処置を開始する直前に、ヒアルロニダーゼを第1ウェルに加えて、約20 IU/mLの最終濃度を得る。
- 酵素を含む第1ウェルに限られた数のCOC(最大6個)を入れて、積雲細胞を分散させる。
- 積雲細胞およびコロナ細胞の酵素除去を強化するために、最大30sの約250μmのパスツールピペットを通して卵母細胞を繰り返しピペット化して、積雲細胞のストリッピングを行います。初期細胞解離が観察された後、卵母細胞をHEPES緩衝培地のみを含む第2ウェルに移し、酵素の最小量を持ち越すことに注意を払う。
- さらに、内径が減少するデニールドピペット(170〜145μm)を使用してコロナ細胞を除去します。厳密に必要な場合にのみ、下径(135μm)を使用してください。
- 酵素を洗い流すために、裸卵母細胞を慎重に洗います。
- 脱分後、逆顕微鏡下で卵母細胞を調べて、その完全性と成熟段階を評価します。MII卵母細胞を未熟なもの(生殖小胞および転移I)から分離する。
- MII卵母細胞をガラス化領域に移動し、凍結保存をすぐに行います。実験室のシートを更新します。
6. 卵母細胞ガラス化
注:卵母細胞の検索の38時間以内および脱分直後に卵卵子のガラス化を行ってください。ここで説明するガラス化手順は、室温(RT)で、操作中に卵母細胞を損傷しないように、内径170μmのストリッパーピペットを使用して達成する必要があります。
- 手順の約30分前に、平衡溶液(ES)とガラス化溶液(VS)をRT(25〜27°C)に持ち込みます。
- 患者の名前とID、治療ID、凍結日、卵母細胞の数、およびクライオバーコードを適切にラベル付けします。
- 新鮮な液体窒素で上部まで使い捨て冷却ラックを充填し、殺菌プロセスを開始します。
- ガラス化プレートに患者の名前とIDを付けて( 材料表参照)にラベルを付けます。
- 各バイアルを慎重に反転して使用前に内容物を混合し、6 mmペトリ皿の蓋を30 μLのHEPESバッファリング媒体(5%HSA)、30 μLの隣接するESドロップで準備します。
注:媒体の蒸発を制限するために使用する直前にドロップを配置します。 - 直径170μmのストリッパーピペットを使用して、最初のドロップに、可能な限り小さい媒体の体積で卵母細胞(最大9個)を入れる。ストリッパーピペットを使用して、ドロップn.1とn.2の間に媒体のブリッジを作成して、CPAの濃度を徐々に増加させます(図1A)。
- 最初のドロップで卵母細胞を3分間インキュベートします。ES (n.3)の30 μLの3番目のドロップを追加します。3 分後、卵母細胞を ES の 2 番目のドロップに移し、ドロップ n.3 と n.2 の間に中型ブリッジを作成します (図 1B)。卵母細胞を3分間ドロップn.3でインキュベートします。
- インキュベーション中に、使用されるクライオデバイスごとにESの30μLドロップを1つ追加します(9個の卵母細胞が凍結保存される場合は、ESの各ドロップに3つの卵母細胞を含むESの3滴を置きます)。卵母細胞を純粋なES溶液に移動し、6-9分間放置します(収縮後の初期サイズが回復するまで) (図1C)。
- 1 mLのVSで中央ウェル皿(60 x 15 mm)を用意します。最初の6分の終わりに、凍結保存される卵母細胞をVS溶液に移し、できるだけ少ない媒体を放出する。卵母細胞を1分間VSのままにし、ESの過剰を取り除くために皿の下から上に移動して慎重に洗います。
- インキュベーションの分の終わりの約10 s、顕微鏡の下に凍結装置を置き、黒いマーク(すなわち、クライオデバイスの先端)に焦点を合わせます。黒いマークの横にあるクライオデバイスの上に、最小量のVS(図2A)を置きます。
- ストライパーピペットを卵母細胞から離し、過剰なVS培地(図2B)を取り除き、卵母細胞が薄い層の媒体で覆われたままになるようにします(図2C)。
- 液体窒素に素早く凍結装置を突き落とし、表面から気泡を取り除くために急速に揺れる。クライオデバイスの保護キャップをピンセットで保持し、液体窒素で満たします。その後、液体窒素にプロピレンストリップを保ちながら、それに凍結装置を挿入します。
- 以前に患者の情報でラベル付けされた VisioTube にクライオデバイスを保存します。実験室のシートを更新します。
7. 卵母細胞の温暖化
- 手順の約30分前に、解凍液(TS)、希釈液(DS)、洗浄液(WS)をRT(25〜27°C)に温めます。慎重に各バイアルを2回反転し、内容を混ぜます。中央ウェルペトリ皿にTSの1 mLを入れ、手順を開始する前に少なくとも1時間37°Cでそれを温める。
- 患者の名前とIDとソリューションの種類ですべてのプラスチック用品にラベルを付けます。目撃者に、クライオデバイスに関する患者の情報を確認してもらいます。
- 各クライオデバイスを温めるには、第1ウェルに200 μLのDSを、第2ウェルと第3ウェル(それぞれWS1とWS2という名前)に同量のWSを備えた6ウェルプレートを用意します。蒸発を防ぐために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または無菌水をウェルの外側の領域に加えます。
- TS皿をインキュベーターから取り出し、顕微鏡の下に置きます。顕微鏡の焦点をペトリ皿の中央に合わせます。
- 慎重にねじれ、液体窒素にプロピレンストリップを維持しながら、凍結装置の保護キャップを取り外します。液体窒素からTSにできるだけ早く凍結装置を移して、脱窒の危険を回避し、カウントダウン(1分)を開始します。
- 凍結装置の先端(すなわち、黒いマーク)に焦点を当てることによって卵母細胞を局在化する。ストリッパーピペットを使用して、凍結装置から卵母細胞を解放します。
注:凍結装置から卵母細胞を吸引しないようにしてください。彼らはTSに移動するまで、穏やかにそれらにいくつかのメディアを解放します。 - 直径170μmのストリッパーピペットを使用して、卵母細胞を少量のTSでDSに移し(勾配を作成)、DSに3分間放置します。卵母細胞をWS1に同様に移動し、5分間放置します。最後に、卵母細胞をWS2に1分間転送します。
- 卵母細胞を適切な前平衡化されたIVF培養培地に移し、細胞質内精子注射(ICSI)を進める前に1時間インキュベートする。実験室のシートを更新します。
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Representative Results
センターにおける不妊治療の保全プログラムの概要
12年間(2008-2020年)、285人の女性が収集された成熟した卵のコホート全体のガラス化を伴う少なくとも1つの卵母細胞検索を受けた。これらの女性のほとんど (n = 250) は 1 回の検索を受け、35 は複数の検索を受けました。卵ガラス化のための卵母細胞の検索を受ける理由は、4つのカテゴリに要約されています:医療(癌を除く)、癌、非医学的、および他。卵ガラス化のための単一の卵母細胞の検索を受けている250人の女性のうち、8%が癌以外の医学的理由を持っていた(10子宮内膜症、 3骨髄腫、4卵巣嚢腫、1ヒドロサルピンス、16%が癌(31乳癌、3卵巣癌、2大腸癌、2ホジキンリンパ腫、1人の外陰癌e 1子宮頸癌)、53%が非医学的理由を有し、23%が他の理由(精子の43欠失、OHSのリスク10、OHSSのリスクは4、感染、10)この分布は卵ガラス化のために複数の卵母細胞の検索を受けている患者の間で異なっていた。具体的には、9%が癌以外の医学的理由(子宮内膜症1、2減少卵巣予備軍)、6%が癌(2乳癌)、80%が非医学的理由を有し、3%が他の理由(精子の1欠切を取り出した)を有していた。卵ガラス化のために複数の卵母細胞の検索を受けている患者は誰もそれらの卵を温めなかったが、単一の卵ガラス化サイクルを受けている250人の女性のうち78人がそれらの卵母細胞を使用するために戻った(図3)。
表1は、関連する理由に従ってクラスター化された単一の卵母細胞ガラス化サイクルを受けている250人の女性のデータを要約する。卵ガラス化の医学的理由を有する患者および癌のために不妊治療を受けている患者は若く(平均母性年齢<35歳)であり、非医学的または他の理由を有する患者よりも優れた卵巣予備軍(より高いAFC)を示した。しかし、平均成熟率(MII卵母細胞数/取得したCOCの数)はわずかに低く(72-73%対77-79%)、平均でガラス化された卵母細胞の数は4群(9-10卵母細胞)で類似していた。重要なことに、腫瘍学的患者の40人中9人(22.5%)は、化学療法または放射線療法を開始する前に時間が限られていたため、ランダムスタート卵巣刺激プロトコルを受けた。癌以外の医学的理由(53%)の患者の約半数と卵ガラス化の他の理由(76%)を持つ患者の大半が実際に温暖化のために戻ってきたことは興味深い。逆に、癌の不妊治療を受けた患者(17.5%)または非医学的理由(13%)がIVFにガラス化卵母細胞を使用した患者は非常に少なかった。また、戻った患者のガラス化と温暖化の間の経過時間は顕著である:平均して、癌以外の医学的理由を有する患者では平均283日、他の理由の患者では132日、腫瘍学的患者では1264日、非医学的理由を有する患者では1547日である。これらすべての関連する違いに関係なく、生存率は同様であった(83-88%、平均で8-11卵母細胞が温め、7〜9個の卵母細胞が生存した)4群の患者間で、卵子ガラス化および温暖化プロトコルの有効性と安全性を確認した。さらに、生存率はガラス化と温暖化オペレータの経験とは無関係である(図4A、B)。表1は、卵母細胞ガラス化の非医学的理由を有する患者を除いて、〜70%である4群における受精率を示す(〜80%)。しかし、これらのデータは、受精結果27に対する小さなサンプルサイズと精子因子のバイアスに匹敵しない。
図1:卵母細胞凍結保存用の中液滴構成 徐々に平衡を行うために、卵母細胞は最初にBSの(A)ドロップに置かれ、ESの一滴(B)と混合される。 3分間のインキュベーションの後、(C)ES溶液の3番目の滴を混合し 、卵母細胞を6〜9分間インキュベートする。略語: HEPES = 4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジンタンスルホン酸;BS = ヘペスバッファリング媒体;ES = 平衡解。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:凍結保存装置に卵母細胞を積み込む。卵母細胞は、(A)の1つの小さなVSの凍結装置の上に置かれます。(B) ストリッパーピペットは卵母細胞から離れ、(C)VSの過剰は再吸引され、各卵母細胞の周りに薄い層を残す。略語: VS = ガラス化溶液。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ローマ生殖医学研究所で行われた卵母細胞ガラス化サイクル(2008年~2020年) 12年間で、250人の患者が卵母細胞ガラス化のための単一の卵母細胞検索を受け、35人が複数の卵母細胞検索サイクルを受けた。卵母細胞ガラス化の固有の理由を図に示す。温暖化のために戻る患者(n=78)は、単一の卵母細胞ガラス化サイクルを受けた女性のグループにのみ属する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:温卵母細胞のコホート当たりの平均生存率(A)ガラス化と(B)温暖化オペレーターの経験。各患者は最初の温暖化サイクルのためにだけ含まれている。統計的に有意差は、マン・ホイットニー U-検定を用いて評価した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:平衡化手順の開始時と終了時における卵母細胞形態平衡手順の結果を決定するために、手順を開始する前に(A)卵母細胞形態にアノセトすることが有用である場合がある。(B)凍結保護剤溶液に最初に曝露した後に卵母細胞の急激な収縮が観察される。平衡化手順は、卵母細胞が初期容積を回復した時点で完了したと考えられる。スケールバー= 25 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 卵母細胞ガラス化の理由 | 癌以外の医療(n=19) | 癌 (n=40) | 非医療 (n=133) | その他 (n=58) |
| 卵母細胞検索における母性年齢、平均±SD | 33.6±6.4年 | 34.6±5.9年 | 37.0±3.4年 | 38.2±4.3年 |
| 基礎 FSH,平均±SD | 7.5±4.2 IU/L | 7.6±1.7 IU/L | 7.8±4.1 IU/L | 8.8±5.2 IU/L |
| AMH、平均±SD | 1.8±1.7 ng/mL | 1.9±0.2 ng/mL | 2.2±2.4 ng/mL | 3.0±2.5 ng/mL |
| AFC、平均±SD | 12.7±5.0 | 13.3±7.0 | 11.6±6.1 | 10.7±6.7 |
| BMI、平均±SD | 20.1±1.5 | 21.8±1.6 | 20.2±3.1 | 22.9±3.6 |
| 刺激の持続時間、平均±SD | 10.0±1.5 | 9.6±1.7 | 9.9±2.1 | 10.3±2.1 |
| 9/40, 22.5% | ||||
| ランダムな開始 | ||||
| コク、合計、平均±SD | 239 | 551 | 1493 | 592 |
| 12.6±5.3 | 13.8±9.1 | 11.2±7.1 | 10.2±8.5 | |
| MII卵母細胞、合計、平均±SD | 167 | 400 | 1161 | 462 |
| 8.8±3.3 | 10.0±7.2 | 8.7±5.7 | 8.0±6.7 | |
| 成熟率、平均±SD | 72.4±13.6% | 72.1±19.6% | 79.5±17.5% | 77.4±22.2% |
| 温暖化のために戻る患者、ガラス化を受けた患者の合計% | 10/19, 52.6% | 7/40, 17.5% | 17/133, 12.8% | 44/58, 75.9% |
| ガラス化と最初の温暖化の間の日数、平均±SD | 283±225 | 1264±764 | 1547±709 | 132±203 |
| 温めたMII卵母細胞、合計平均±SD | 82 | 66 | 191 | 409 |
| 8.2±2.8 | 9.4±4.8 | 11.2±5.8 | 9.3±7.2 | |
| 生き残ったMII卵母細胞、合計平均±SD | 73 | 55 | 160 | 345 |
| 7.3±3.3 | 7.9±4.0 | 9.4±4.8 | 7.8±6.9 | |
| 生存率、平均±SD | 87.6±18.1% | 83.2±1.7% | 85.4%±14.5% | 84.7±21.9% |
| 精子因子 | ||||
| N、n、% | 5/10, 50% | 4/7, 57% | 13/17, 76% | 13/44, 29% |
| MMF、n、% | 3/10, 30% | 3/7, 43% | 3/17, 18% | 17/44, 39% |
| OAT、 n、 % | 2/10, 20% | - | 1/17, 6% | 11/44, 25% |
| NOA、 n、 % | - | - | - | 3/44, 7% |
| 受精率、平均±SD | 70.0±14.4% | 70.0±17.0% | 78.5±20.6% | 71.0±24.3% |
表1:卵母細胞ガラス化の単一サイクルを受けている患者。 略語: FSH = 卵胞刺激ホルモン;AMH = 抗ミュレリアンホルモン;BMI = ボディマス指数;COC = 積雲卵母細胞複合体;MII = メタフェーズ II;N = ノルモクノ精子;MMF =中等度の男性因子(1-2精子欠損);OAT = オリゴアセノテラト動物精子;NOA=非閉塞性無精子症(精巣精子抽出を通じて精子を採取した)。
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Discussion
臨床に関する考慮事項
卵巣組織凍結保存や体外成熟などの新たな戦略が探求されているが、COS後の卵母細胞ガラス化は生殖能力保存のためのゴールドスタンダード技術である。このシナリオでは、ほとんどのがん患者が癌治療を開始する前に1つの卵巣周期の恩恵を受ける可能性があるため、取得および凍結保存された卵母細胞の数は、可能な限り最短時間で最大化する必要があります。したがって、卵巣予備軍を完全に利用し、将来の出生の累積確率を高めるためには、適切な卵巣刺激プロトコルが重要であり、卵母細胞検索時の母親の年齢に強く依存する結果である。この点に関して、不妊治療保存目的のための卵母細胞ガラス化のための理想的な年齢はまだ29、35年18 年または37歳、30歳、31年の間にコンセンサスが必要とされている。しかし、年齢に基づいて成功率に関する適切なカウンセリングを受けている場合、37歳以上の女性を含むすべての患者が不妊治療の保存にアクセスできる必要があります。
薬のプロトコルと開始用量は、婦人科医の判断に従って、最も重要なのは、利用可能な時間に基づいて、32、33に基づく必要があります。時間が問題でない場合は、早期の濾胞期に従来の刺激を開始することをお勧めします。しかし、必要に応じて、ランダム開始アプローチは、緊急の癌/医療34、35を開始する際の遅延を最小限に抑えることが可能である。卵胞の開発は、卵胞募集の複数の波が単一の卵巣周期を通して記述されているように非常に動的なプロセスであると報告されています。.この現象の背後にある生物学的メカニズムはまだ明らかにする必要がありますが、COSが開始される月経周期の段階とは無関係に有能な卵母細胞を取り出し、凍結保存することができる。
このセンターでは、卵巣刺激は、典型的には、GnRH拮抗プロトコルおよび150-300 IU/日の組換えFSHまたはヒト更年期性性性腺刺激ホルモンを用いて行われる。35歳以上の患者の特定の集団において、LH欠乏症、または標準COS後に最適でない応答を示す、LHは、インスリン様成長因子116、37、38との相乗作用を通じて卵胞の募集および成長を増加させるためにCOSの間に添加されるかもしれない。さらに、GnRH拮抗作用プロトコルに続いてGnRHアゴニストトリガーが続いて、卵巣応答を最大化し、OHSS39のリスクを最小限に抑えるための短く、安全で、非常に便利な刺激プロトコルであることが報告されている。乳癌などのエストロゲン感受性疾患を有する患者では、レトロゾールなどのアロマターゼ阻害剤に関連するゴナドトロピンが20に投与される。
実際、最近のレビューでは、先天性欠損、悪性腫瘍再発、および死亡率の増加の点で合併症のない従来の刺激と同様の卵巣応答を伴うレトロゾールが関与することが示された。同様に、エストロゲン感受性腫瘍の場合にはCOS中にタモキシフェンが使用される可能性があり、これは、レトロゾールのように、卵母細胞能力41,42に影響を与えなかった。しかし、これはより大きな研究で確認する必要があります。このセンターでは、エストラジオール感受性腫瘍の場合には、卵母細胞の検索後7日目までの刺激の1日目からレトロゾールが投与される。抗癌治療をさらに遅らせるであろうCOSの最も重要な合併症であるOHSSのリスクは、特に高いAFCを有する若い患者において考慮されるべきである。これらのケースでは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)の代わりにGnRHアゴニストによる排卵を引き起こすことが有益であることが証明されている。他に予防しなければならない問題は、(i)血栓塞栓症であり、COS中の低分子量ヘパリンの投与を必要とする、および(ii)COS43後の卵巣応答の低下である。後者を補うために、単一の卵巣周期における2つの連続した刺激が行われるかもしれない。DuoStimとして知られているこの新しい非伝統的なCOSプロトコルは、短い時間枠(〜15日)で卵胞および黄体相刺激と2つの卵母細胞の検索を伴い、将来44、45、46で不妊治療の保存目的のために調査されるべきである。
女性の不妊治療の保存のための他の可能な戦略は:(i)卵巣組織凍結保存は、思春期前の女性のために利用可能な唯一の選択肢です。この可能性は、生殖および内分泌活性を回復し、ホルモン刺激が必要とされなくて癌治療を開始する遅れを回避するために有望である。しかし、それはまだ実験的であり、後の移植で腹腔鏡手術を必要とし、直交性癌再送のリスクがあります。(ii)胚凍結保存は、温暖化後の生存率の上昇を伴うが、癌治療を遅らせるが、男性のパートナーまたはドナーが関与することを要求し、それによって女性の将来の生殖自律性47も制限する。また、一部の国では法的な制限が適用される場合があります。これらの制限を考慮すると、卵母細胞ガラス化は最も確立され、倫理的に受け入れられるアプローチと考えられています。理想的には、生殖年齢で癌の影響を受ける女性が治療を受けるすべての主要な病院は、不妊治療の保存のためのプログラムを提供する必要があり、このプログラムへの平等なアクセスを確保するために、これらの患者のための全体のプロセスは無料でなければなりません。それでも、卵母細胞凍結保存は、プロセス48における卵母細胞能力に影響を与えない十分な専門知識を持つセンターでのみ行われなければならない。
ガラス化プロトコルとトラブルシューティングの重要なステップ
ガラス化は、細胞の主な原因となる氷の結晶核化と成長を妨げるガラス状の凝固を誘導する疑似第二次相転移(IUPAC化学用語集)です。適切なガラス化を実現するには、少なくとも2つのCPUA(通常、浸透剤としてエチレングリコールとDMSO、非浸透剤としてスクロース)と非常に高い冷却速度(>20,000°C/分)を組み合わせて、積載量を最小限に抑えるか、液体窒素(開放デバイス)へのサンプルの直接暴露によって達成される必要があります。卵母細胞は体の中で最も大きな細胞であるため、最大の量の水が含まれています。したがって、それらは胚よりも凍結傷害に敏感である。卵母細胞凍結保存の間、細胞内小器官(例えば、細胞骨格またはマイオティックスピンドル)への損傷、膜透過性の変化、透明帯硬化、卵母細胞活性化、生化学的経路の変化、およびおそらく細胞死が49に起こり得る。このため、卵母細胞の生存率と発達能力を維持するためには、複数の因子間の微妙なバランスを確保する必要があります。ガラス化後の生存率の一貫性を達成し、ベンチマークレベルに達するためには、手順のすべての重要なステップを厳密に制御する必要があります。
公認、細胞の浸透率、および冷却速度
ガラス化の確率を高めるためには、培地の粘度(したがってCPA濃度)を最大化する必要があります。しかし、公認の毒性は常に制御50の下に保たれるべきである。この作業を行うためには、CPAへの細胞暴露時間と負荷量の両方を最小限に抑え、常に室温(25~27°C)51で動作することが重要です。他のプロトコルは、公認とクライオデバイスの異なる組み合わせを含み、37 °Cで行われます。ただし、ここでは説明されていません。したがって、この原稿のノート、代表的な結果、および議論のセクションは、ここで詳述されるガラス化プロトコルにのみ適用されます。
凍結保存の間、卵母細胞は、細胞脱水および細胞質収縮を促進するために増加した浸透量濃度のCPA溶液に曝露される。温暖化時には、浸透量が減少した溶液に曝され、細胞質体積を回復します。ガラス化の間、卵母細胞は脱水され、細胞体積の意図しない変動は、重度の浸透衝撃を引き起こし、それにより、52を温めた後の生存および発生可能性を損なう。最適な冷却速度を見つけることは、オスモラリティ53 および細胞発達電位54に影響を及ぼす細胞生存率を維持するための重要な側面である。例えば、細胞が最適な速度よりも遅い冷却速度にさらされると、細胞死につながる高調的な状態に広範囲に曝される可能性があります。
最適な冷却速度を達成するためには、負荷量を最小限に抑え、平衡プロセスの速度に影響を与えないためRTを制御し、サンプルを液体窒素に直接曝す必要があります。平衡化が達成された時期を評価する1つの方法は、手順の開始前に卵母細胞の形態(特に、腹膜空間の幅と透明帯の厚さ)にアノベートすることです(図5A)。細胞体積減少の初期段階(図5B)の後、卵母細胞は初期ボリュームを回復することが期待される(図5C)。ガラス化加温溶液を緩衝するジウテリオンのために空気雰囲気下での卵母細胞処理中に正しいpHが維持されるが、中等浸透率は、代わりに温度53に特に依存する。したがって、皿調製の方法は、可能な有害な効果55を低減するために重要である。
オイルオーバーレイは、蒸発を防ぎ、IVFメディア56の浸透率の増加を避けるために、確かに極めて重要です。しかし、ガラス化や加温手順を行っている間は使用できません。したがって、いくつかのヒントはオペレータにとって重要です: (i) 使用する前にできるだけ速く、すぐに液滴を準備します。(ii) 浸透量の変化を最小限に抑えるために大量の液滴を考慮する(<30 μL は推奨されない)。(iii) 環境条件を標準化できない場合は、6ウェルプレートを使用することができ、滅菌水またはPBSを隣接する貯水池に添加して蒸発を制限することができます。(iv)ボトルが繰り返し開いている場合は、浸透性が変化する可能性があるとして、培地のバイアルの最初の開口部の日付に注意を払う。
卵母細胞の温暖化と卵母細胞の不整化
生存率の一貫性に影響を与える可能性のある最も重要なステップは、間違いなく温暖化プロセス57です。このステップの間に、CPAは卵母細胞から徐々に取り除かれ、潜在的な細胞傷害効果を防ぐために希釈される。脱透、すなわち、ガラス化溶液の温暖化時に氷核または氷結晶の形成、または誤って蒸気中の監査、輸送、または貯蔵中に、ガラス化58、59、60の主なリスクの1つである。したがって、温暖化時の逸脱や損傷を防ぐために、プロセスの最初と最後のステップの間の温度差を最大化する必要があります。異なる速度でガラス化および温暖化を受けるマウス卵母細胞のSekiとMazur57が示すように、温暖化が速いほど生存率が高い。TSの体積と温度は制御する主な要因です:TSは37°C(手順の少なくとも1時間前)に適切に温め、液体窒素ラックはその容量の端まで充填し、実体顕微鏡にできるだけ近くに置く必要があります。液体窒素からTSに凍結保存キャリアを移す間、オペレータはできるだけ速くする必要があります。ガラス化の高効率のために、普遍的な温暖化プロトコルは、関係する凍結プロトコルに関係なく使用することができ、卵母細胞が別のIVFセンター61から輸入された場合でも、すべての温暖化サイクルの管理を容易にする。
オープンデバイスと汚染のリスク
オープンシステムの採用と液体窒素へのサンプルの直接暴露は、このプロトコルの有効性を支える非常に高い冷却および温暖化率を達成するために必要とされる。ガラス化は、クロスコンタミネーションのリスクが低い手順ですが、非常に少量を含み、任意の推定ウイルス負荷を希釈するいくつかのサンプル洗浄の後に行われるため、安全性を高めるためにすべての予防措置を採用することが不可欠です。現在の証拠に基づいて、閉鎖されたシステムは、少なくとも卵母細胞のガラス化62、63のためにオープンシステムに対して競争力のある代替手段を提供しない。液体窒素との直接接触に伴うリスクを最小限に抑えながら開いたガラス化システムの有効性を維持するために、後者は紫外線照射64、65によって殺菌され得る。あるいは、蒸気貯蔵タンクが使用され得るが、これは従来のものよりも汚染の危険性が低いが、卵母細胞の生存率66、67を保存するのに有効であることが証明されている。
卵母細胞ガラス化プログラムの主要業績評価指標の常時モニタリングの重要性
IVFの研究室では、主要業績評価指標(KPI)のモニタリングは、結果68を監視し、常に改善するために不可欠です。一般に、プロセスと手順を監視するための KPI を定義する場合、構造、プロセス、および結果の 3 つの主要な領域を考慮する必要があります。構造KPIは、物理的および人的資源の特性を概説することによって、IVFラボの品質を測定します。凍結保存プログラムの施設に関連する構造KPIの例としては、一定期間に行われた凍結保存を必要とするART手順の総数に対する凍結タンクの数や、凍結室の合計平方メートルに対する凍結タンクの数が挙げられます。しかし、人的資源、特に、ガラス化のような繊細な手順を扱う際には、オペレータのスキルが最も重要です。実際、ガラス化技術は非常に効果的ですが、厳密に制御されなければならない厳しいタイミングを持ついくつかの手続き段階を含む困難な手順です:非常に少量の著しく粘性のある媒体は非常に短い期間で管理されるべきです。
特定の冷却パラメータ設定を持つ凍結機は、手順に関与していません。したがって、プロトコルの詳細とトレーニングの標準化が不可欠です。手動プロセスには、一貫した、非常に再現性の高い細胞生存率を得るために満たされなければならない厳格なスキル要件があります。特定のトレーニングは、各初心者のオペレータに提供して、手順のすべての重要なポイント、特に、サンプルのCPAへの暴露時間および高粘性媒体における細胞の取り扱いに熟練する必要があります。しかし、Dessolleと共著者によると、69 は、硝子化手順の学習曲線は、熟練度の達成が主に操作の課題によって制限されるため、ジュニア胚学者にとってもそれほど長くあってはならない。ガラス化の専門知識が達成されると、個々のオペレータの性能は、コンセンサス論文70によって確立されたコンピテンシー値の維持を定期的に評価するためにKPIを使用して正確かつ定期的に検証されなければならない。さらに、結果に影響を与えないため、オペレータの信頼/能力は同等でなければなりません。
プロセス KPI は、IVF ラボの動作を測定します。ガラス化・温暖化の議定書や手順は適時に行われるべきであり、卵母細胞の発生能力だけでなく、液体窒素を取り扱いながらオペレータの安全を保つために適切な浸透性と温度を維持することに特に注意を払って、培養条件の変動を最小限に抑える必要があります。プロセスKPIの例としては、年間IVF処置の数あたりの液体窒素の取り扱い中の実験室スタッフの負傷の割合、ガラス化/温暖化手順中に失われた/損傷したディス玉子/胚の割合、および年間の手順数あたりの監査が含まれます。
最後に、結果KPIは、IVF実験室の有効性を測定し、一般に、ICSIの時点で形態学的に無傷の卵母細胞の割合として定義される後の温暖化卵母細胞生存を指す(卵母細胞のガラス化の場合、コンピテンシー値は>50%、ベンチマーク値は70%)さらに、受精率(同等の患者集団から中心に授精した新鮮な卵母細胞より<10%低い)、胚発生(新鮮な卵母細胞を使用する同等の患者集団と同じ)、移植(<10〜30%低い新鮮な胚の同等の集団よりも低い)は、生化学卵母細胞70の結果KPIとして適用される。しかし、臨床結果は、欠陥のある臨床処置71、72よりもカップル特異的な特性の影響を受ける。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
何一つ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection | |||
| Equipment | |||
| Hot plate | IVF TECH | ||
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermometer | |||
| Test tube Warmer | |||
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Vacuum Pump | Cook | K-MAR-5200 | |
| Consumables | |||
| CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| Ovum Aspiration Needle (Single lumen) | Cook | K-OSN-1730-B-60 | |
| Primaria Dish | Corning | 353803 | Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish |
| Round- bottom tubes | Falcon | 352001 | Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap |
| Round- bottom tubes | Falcon | 352003 | Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap |
| Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | |
| Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE |
| Denudation | |||
| Equipment | |||
| CO2 incubator | Eppendorf | Galaxy 14S | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl |
| Human Serum Albumin | thermoFisher Scietific | 9988 | |
| Hyaluronidase | Fujifilm Irvine Scientific | 90101 | 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF |
| IVF culture dish (60 x 15mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
| Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | 1 mL for pasteur pipettes |
| Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE |
| stripping pipette tips (140 µm) | Cook | K-FPIP-1140-10BS-6 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| stripping pipette tips (130 µm ) | Cook | K-FPIP-1130-10BS-7 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification | |||
| Equipment | |||
| Electronic Timer | |||
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
| Human Serum Albumin | Fujifilm Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
| Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
| stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification Freeze kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90133-so | 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL) |
| Vitrifit | Coopersurgical Origio | 42782001A | VitriFit Box |
| Warming | |||
| Equipment | |||
| Electronic Timer | |||
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
| k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
| CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
| IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| SAtripping pipette tips (300µm) | Cook | K-FPIP-1300-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification Thaw kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90137-so | 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL) |
References
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