Oocyte cryopreservation er anerkendt af flere internationale videnskabelige samfund som guldstandarden for fertilitetsbevarelse hos postpubertale kvinder. Passende kliniske strategier og laboratoriestrategier sikrer maksimal effektivitet, effektivitet og sikkerhed ved fertilitetsbevarelsesbehandlinger.
Bevarelse af kvinders fertilitet er afgørende i et multifunktionelt sundhedssystem, der tager sig af patienternes fremtidige livskvalitet. Oocyte cryopreservation er anerkendt af flere internationale videnskabelige selskaber som guldstandarden for fertilitetsbevarelse hos postpubertale kvinder, for både medicinske og ikke-medicinske indikationer. De vigtigste medicinske indikationer er onkologiske sygdomme, gynækologiske sygdomme som svær endometriose, systemiske sygdomme, der kompromitterer æggestokkenes reserve, og genetiske tilstande, der involverer for tidlig overgangsalder. Dette papir beskriver hele det kliniske og laboratoriemæssige arbejde med en fertilitetsbevarelsesbehandling ved at skitsere anbefalinger til objektiv og evidensbaseret rådgivning. Desuden fokuserer den på effektiviteten af proceduren og beskriver de mest hensigtsmæssige strategier til fuldt ud at udnytte æggestokkene reserve og maksimere antallet af oocytter hentet på kortest mulig tid. Evalueringen af æggestokkene reserve, definitionen af en ideel stimulation protokol, samt oocyte hentning, denudation, og vitrification procedurer er blevet detaljeret sammen med tilgange til at maksimere deres effektivitet, effektivitet og sikkerhed.
Udviklingen og implementeringen af et effektivt kryopræserveringsprogram for humane oocytter har været et betydeligt gennembrud inden for reproduktiv medicin. Ifølge de seneste beviser, vitrification er den mest effektive strategi til cryopreserve metafase II (MII) oocytter, da det resulterer i statistisk højere overlevelsesrater i forhold til langsom frysning, uafhængigt af patientpopulationen (ufrugtbare patienter eller oocyt donation program)1,2,3. De bemærkelsesværdige resultater af oocyt vitrificering førte praksis udvalg American Society for Reproductive Medicine (ASRM) og Society for Assisted Reproductive Technology (SART) til at udtale denne teknik til at være den mest effektive til elektiv fertilitet bevarelse hos postpubertal kvinder, for både medicinske og ikke-medicinske indikationer4,5,6. Medicinske indikationer for fertilitetsbevarelse omfatter (i) kræft og autoimmune sygdomme, der kræver behandlinger7 såsom strålebehandling, cytotoksisk kemoterapi og endokrine terapi (hvis skadelige virkning på æggestokkene reserve er forbundet med moderens alder samt type og dosis af behandlingen); — sygdomme i æggestokkene, der kræver gentagen eller radikal kirurgi (f.eks. endometriose)8 og (iii) genetiske tilstande (f.eks. X-skrøbelige) eller for tidlig ovariesvigt. Derudover er fertilitetsbevarelse blevet en værdifuld mulighed for alle kvinder, der ikke har nået deres forældremål af ikke-medicinske årsager (også kendt som social indefrysning).
Uanset indikationen for fertilitetsbevarelse og i henhold til de store internationale retningslinjer for fertilitetsbevarelse bør alle patienter , der er villige til at vitrificere deres oocytter, modtage passende rådgivning for at blive informeret om deres realistiske chance for succes, omkostninger, risici og begrænsninger ved proceduren9,10,11,12,13. Vigtigst er det, bør det være klart, at vitrifying en kohorte af MII oocytter ikke sikrer en graviditet, men at det giver en større chance for succes for fremtidig in vitro befrugtning (IVF) behandling, hvis det er nødvendigt14. I denne henseende er kvindens alder på tidspunktet for oocyt vitrifikation helt sikkert den vigtigste begrænsende faktor15 som avanceret mødrealder (AMA; > 35 år) er hovedårsagen til kvindelig infertilitet16. Ud over en progressiv reduktion i æggestokkene reserve, AMA er forbundet med en svækkelse af oocyt kompetence på grund af defekte fysiologiske veje såsom stofskifte, epigenetisk regulering, celle cyklus checkpoints, og meiotisk adskillelse17. Derfor afhænger det rimelige antal æg, der skal vitrificeres, hovedsageligt af moderens alder. Hos kvinder yngre end 36 år, mindst 8-10 MII oocytes18 er forpligtet til at maksimere chancen for succes. Generelt gælder det, at jo højere antallet af forglassede oocytter er, jo højere er sandsynligheden for succes. Derfor er skræddersy æggestokkene stimulation i henhold til æggestokkene reserve markører såsom anti-Müllerian hormon (AMH) niveauer eller antral follikeltal (AFC) er afgørende for fuldt ud at udnytte æggestokkene reserve på kortest mulig tid.
Sikkerheden ved hele proceduren er det andet centrale spørgsmål, når du tilmelder patienter til fertilitetsbevarelse. Klinikere bør anvende de bedste strategier til at minimere risici og forebygge (i) ovarie hyperstimulation syndrom (OHSS) ved hjælp af sikre tilgange såsom gonadotrophin-frigive hormon (GnRH) antagonist protokol efterfulgt af en GnRH agonist udløse19 og (ii) fjernbetjeningen, endnu muligt, risiko for peritoneal blødning, skade på bækken strukturer (ureter, tarm, tillæg, nerver), eller bækken infektion under oocyt hentning. Endelig (iii) traditionelle regimer til stimulering er forbundet med supraphysiologic serum østradiol og derfor ikke anbefales i østrogen-følsomme sygdomme som brystkræft. Protokoller, der involverer aromatasehæmmere (f.eks. letrozofødder eller tamoxifen), er mere velegnede i disse tilfælde20,21. I laboratoriet indstilling, den mest udbredte protokol for oocyt vitrification er stadig den første beskrevet af Kuwayama og kolleger2,23, som består af en trinvis procedure, der involverer gradvis tilsætning af kryoprotectants (CPA’er). I første fase (ligevægt/dehydrering) eksponeres oocytter i en CPA-opløsning, der indeholder 7,5% v/v ethylenglycol og 7,5% v/v dimethylsulfoxid (DMSO), mens de i anden fase oocytter flyttes til en vitrifikationsopløsning med 15% v/v ethylenglycol og 15% v/v DMSO plus 0,5 mol/L saccharose. Efter en kort inkubation i vitrifikationsmediet kan oocytterne placeres i specielt designede, åbne kryodevices og til sidst kastes i flydende nitrogen ved -196 °C, der skal opbevares indtil brug.
Her er hele det kliniske og laboratoriemæssige arbejde med en fertilitetsbevarelsesbehandling blevet beskrevet ved (i) at skitsere anbefalinger til objektiv og evidensbaseret rådgivning, (ii) med fokus på procedurens omkostningseffektivitet og (iii) beskrive de mest hensigtsmæssige strategier til fuldt ud at udnytte æggestokkene og maksimere antallet af oocytter hentet på kortest mulig tid. Evalueringen af æggestokkene reserve, definitionen af en ideel stimulation protokol, samt oocyte hentning, denudation, og vitrification procedurer vil blive detaljeret sammen med tilgange til at maksimere deres effektivitet, effektivitet og sikkerhed. Da der findes andre protokoller eller tilpasninger af denne protokol i litteraturen, gælder de repræsentative resultater og diskussionsafsnittene i dette manuskript kun for denne procedure.
Kliniske overvejelser
Selv om nye strategier, såsom æggestokkene væv cryopreservation og in vitro modning, er blevet undersøgt, oocyt vitrification efter COS er guld standard teknik til fertilitet bevarelse. I dette scenario, antallet af oocytter hentet og cryopreserved bør maksimeres på kortest mulig tid, da de fleste kræftpatienter kan drage fordel udelukkende af en æggestokkene cyklus, før de er nødt til at påbegynde deres kræftbehandling (r). Således er en or…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
Collection | |||
Equipment | |||
Hot plate | IVF TECH | ||
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Thermometer | |||
Test tube Warmer | |||
Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
Vacuum Pump | Cook | K-MAR-5200 | |
Consumables | |||
CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) | Cook | K-OSN-1730-B-60 | |
Primaria Dish | Corning | 353803 | Corning Primaria Dish 100×20 mm style standard cell culture dish |
Round- bottom tubes | Falcon | 352001 | Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap |
Round- bottom tubes | Falcon | 352003 | Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12×75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap |
Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | |
Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE |
Denudation | |||
Equipment | |||
CO2 incubator | Eppendorf | Galaxy 14S | |
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl |
Human Serum Albumin | thermoFisher Scietific | 9988 | |
Hyaluronidase | Fujifilm Irvine Scientific | 90101 | 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF |
IVF culture dish (60 x 15mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
IVF One well dish | Falcon | 353653 | Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | 1 mL for pasteur pipettes |
Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE |
stripping pipette tips (140 µm) | Cook | K-FPIP-1140-10BS-6 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
stripping pipette tips (130 µm ) | Cook | K-FPIP-1130-10BS-7 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification | |||
Equipment | |||
Electronic Timer | |||
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
Human Serum Albumin | Fujifilm Irvine Scientific | 9988 | |
IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification Freeze kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90133-so | 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL) |
Vitrifit | Coopersurgical Origio | 42782001A | VitriFit Box |
Warming | |||
Equipment | |||
Electronic Timer | |||
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
SAtripping pipette tips (300µm) | Cook | K-FPIP-1300-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification Thaw kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90137-so | 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL) |