हम चिकन भ्रूण के रेटिना और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए इसके उपयोग से शंकु फोटोरिसेप्टर्स की प्राथमिक संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
मानव दिन की दृष्टि रेटिना, फोवे के केंद्र में शंकु फोटोरिसेप्टर्स के कार्य पर निर्भर करती है। विरासत में मिले रेटिना अध: पतन, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के सबसे प्रचलित रूप से पीड़ित रोगी, रॉड फोटोरिसेप्टर्स के उत्परिवर्तन संचालित नुकसान के कारण रात की दृष्टि खो देते हैं, एक घटना जिसके बाद कार्य की प्रगतिशील हानि होती है और शंकु की मृत्यु होती है जिससे अंधापन होता है। आनुवंशिकीविदों ने इस बीमारी के कारण म्यूटेशन के साथ कई जीनों की पहचान की है, लेकिन पहले उत्परिवर्तनों की पहचान ने माध्यमिक शंकु अध: पतन के तंत्र पर सवाल उठाया और कैसे रोडोप्सिन जीन एन्कोडिंग में एक प्रमुख उत्परिवर्तन विशेष रूप से छड़ में व्यक्त किए गए दृश्य वर्णक के लिए शंकु अध: पतन को ट्रिगर कर सकता है।
रोग के एक आनुवंशिक मॉडल में प्रत्यारोपण के इस परिणाम ने छड़ और शंकु के बीच सेल इंटरैक्शन की अवधारणा और रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के सभी आनुवंशिक रूपों में शंकु के गैर-सेल स्वायत्त अध: पतन की अवधारणा का नेतृत्व किया।
शंकु मनुष्यों में सभी फोटोरिसेप्टर के 5% और माउस में केवल 3% शामिल हैं, इसलिए उनका अध्ययन इन प्रजातियों में मुश्किल है, लेकिन पक्षी प्रजातियों में शंकु छड़ से अधिक है। हम अपने विकास के चरण 29 में चिकन भ्रूण के रेटिना से रेटिना अग्रदूत संस्कृति के लिए ९६ अच्छी तरह से प्लेटें अनुकूलित किया है । इन प्राथमिक संस्कृतियों में, शंकु इन विट्रो भेदभाव के बाद कोशिकाओं के 80% का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाएं सीरम की अनुपस्थिति में एक सप्ताह की अवधि में पतित होती हैं। यहां, हम तरीकों और इसके मानकीकरण का वर्णन करते हैं।
इस शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली का उपयोग चूहे रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग द्वारा एपिथेलियम-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (ईडीसीवीएफ) की पहचान करने के लिए किया गया था। Recombinant EdCVF शंकु के पतन को रोकता है।
कशेरुकी प्रजातियों का रेटिना दोहरी है, मंद प्रकाश दृष्टि के लिए रॉड फोटोरिसेप्टर्स और दिन के उजाले, रंग और तीक्ष्णता दृष्टि के लिए शंकु फोटोरिसेप्टर के साथ। रहनुमा दृश्य तीक्ष्णता रेटिना के केंद्र में एक क्षेत्र पर निर्भर करती है, जिसे फोवे कहा जाता है, जो शंकु में समृद्ध होता है, लेकिन कुल मिलाकर, शंकु सभी फोटोरिसेप्टर्स का केवल 5% प्रतिनिधित्व करते हैं। नतीजतन, रहनुमा रेटिना में शंकु का विश्लेषण और विशेष रूप से शंकु की संस्कृति तकनीकी रूप से कठिन है। अन्य सभी स्तनधारी प्रजातियों में कोई फोईया नहीं है और कृंतकों के लिए शंकु का प्रतिशत कम है जो आमतौर पर रेटिना अनुसंधान में उपयोग किए जाते हैं। यह एवियन प्रजातियों के लिए मामला नहीं है, जिसके लिए शंकु इन अच्छी तरह से देखने वाली पक्षी प्रजातियों के रेटिना पर हावी हैं। डायनासोर, जो पारिस्थितिकी तंत्र पर हावी है जब स्तनधारियों पहली बार विकास के दौरान दिखाई दिया, पक्षियों के फिलोजेनेटिक मूल में हैं1। डायनासोर और प्रारंभिक स्तनधारियों के बीच ऐसी प्रतिस्पर्धा के परिणामस्वरूप, स्तनधारियों को ज्यादातर छड़ के प्रभुत्व वाले रेटिना के साथ रात्रिभोज होता है। केवल बाद में विकास के दौरान कुछ स्तनधारी प्रजातियों की दैनिक दृष्टि थी, जिनके बीच वानरों का संबंध है, एक विकासवादी लाभ बन गया। फिर भी , पैतृक अवधि स्तनधारी दृष्टि2,3के विकास में रात्रिभोज की अड़चन के रूप में बनी हुई है ।
रेटिना सेल भेदभाव का अध्ययन करते हुए, एडलर और हैटली ने दिखाया कि फोटोरिसेप्टर भ्रूण दिवस (ईडी) 6 या चरण 294में चिकन से प्राप्त संस्कृतियों में रेटिना विभेदित कोशिकाओं का लगभग 70% प्रतिनिधित्व करते हैं। चिकन रेटिना में शंकु की व्यापकता के कारण, ED6 चिकन भ्रूण से रेटिना कोशिकाओं की संस्कृतियों को शंकु-समृद्ध संस्कृतियों के रूप में विकसित किया गया है5।
मानव के लिए शंकु-मध्यस्थता दृश्य तीक्ष्णता का महत्व एक truism है । आनुवंशिक या उम्र बढ़ने की बीमारियों से प्रभावित लोग जो शंकु समारोह को बदलते हैं, बहुत विकलांग होते हैं। इससे विरासत में मिली रेटिना डिजेनरेशन (आईआरडी) पर अध्ययन के एक बहुत बडे शरीर को बढ़ावा मिला है , जिसके उद्देश्य से इन चकाचौंध करने वाली बीमारियों के लिए उपचार ढूंढना6,7. पहली सफलता, आईआरडी लेबर जन्मजात अमौरोसिस (एलसीए) के एक गंभीर रूप की चिकित्सा के लिए एक पुनर्संयोजन adeno से जुड़े वेक्टर (AAV) का उपयोग कर प्राप्त, जीन थेरेपी8के लिए अवधारणा का एक सबूत है । जिन जीनों के उत्परिवर्तन आईआरडी को ट्रिगर करते हैं, उनकी पहचान जीन थेरेपी का उपयोग करके इन बीमारियों के इलाज की संभावना को खोलती है । फिर भी, इन बीमारियों से 200 से अधिक अलग जीन9में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप कर रहे हैं। यहां तक कि आईआरडी के ऑटोसोमल अप्रभावी रूपों के मामले में, जब रुग्ण जीन की सामान्य प्रति को फिर से शुरू करने से दृश्य कार्य बहाल हो सकता है, तो प्रत्येक व्यक्ति के विकास की आर्थिक लागत कम आम लोगों और उन लोगों के लिए सबसे प्रचलित लोगों के पक्ष में है जिनके लिए आनुवंशिक मूल अज्ञात रहता है। इस तथ्य के नेतृत्व में शोधकर्ताओं को और अधिक सामांय चिकित्सा के बारे में सोचना । एपोप्टोटिक सेल मृत्यु एक आम मार्ग के रूप में दिखाई दी, और इन बीमारियों का एक चिकित्सीय लक्ष्य जो फोटोरिसेप्टर्स के पतन से प्रगति करता है, जिसमें ऑटोसोमल प्रमुख रूपों10,11शामिल हैं। हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण की सफलताएं गायब हैं । आईआरडी, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) के सबसे आम रूप के लिए, आम मार्ग कार्य का माध्यमिक नुकसान है जिसके बाद अंततः शंकु12,13का पतन होता है। शंकु कार्य के नुकसान को रोकने से कारक उत्परिवर्तन14से स्वतंत्र रूप से फोवेया की केंद्रीय दृष्टि संरक्षित होगी ।
आरपी के प्रारंभिक चरण में, छड़ के नुकसान से रॉड-व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता कारक (आरडीसीवीएफ) की अभिव्यक्ति में कमी शुरू हो जाती है, जो न्यूक्लियोरडोक्सिन जैसे 1(एनएक्सएनएल1)जीन द्वारा एन्कोड किया जाता है, जो छड़ और शंकु15के बीच मेटाबोलिक और रेडॉक्स सिग्नलिंग को बाधित करता है। एनएक्सएनएल1 जीन के दो उत्पादों, ट्रॉफिक फैक्टर आरडीसीवीएफ और थिओरडोक्सिन एंजाइम आरडीसीवीएफएल के दो उत्पादों को एन्कोडिंग करने वाले एक पुनर्संयोजन एएवी का प्रशासन सैद्धांतिक रूप से आरपी16के सभी आनुवंशिक रूपों में शंकु दृष्टि हानि को रोक सकता है। हमने दिखाया है कि NXNL1 जीन उत्पाद, RdCVFL, चिकन शंकु समृद्ध संस्कृतियों में व्यक्त किया जाता है17 और जहां यह एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है18। RdCVF और NXNL1 जीन की पहचान एक रेटिना सीडीएनए पुस्तकालय की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग द्वारा की गई थी, जो एक शंकु-समृद्ध संस्कृति से कोशिकाओं के अस्तित्व का उपयोग करके readout19के रूप में । हमने प्रत्येक क्लोन के लिए 8 समानांतर परीक्षणों का उपयोग करके पुस्तकालय के 210,000 व्यक्तिगत क्लोन के बराबर की जांच की। यह जैविक सामग्री, चिकन भ्रूण के रेटिना के लिए आसान पहुंच की आवश्यकता परीक्षणों की एक बहुत बड़ी संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । हमने पाया कि यह अपेक्षाकृत एक साप्ताहिक आधार पर भ्रूण चिकन अंडे प्राप्त करने के लिए आसान था क्योंकि वे व्यापक रूप से अंडा बिछाने मुर्गियां और मांस उत्पादन मुर्गियों के लिए कृषि उद्योग के लिए उत्पादित कर रहे हैं । शंकु-समृद्ध संस्कृतियों के सावधानीपूर्वक मानकीकरण के बाद, प्रणाली शंकु व्यवहार्यता को संरक्षित करने की क्षमता के लिए हजारों अणुओं के परीक्षण का एक आसान, मजबूत और प्रजनन योग्य तरीका प्रदान करती है। ये कोशिकाएं आनुवांशिक जोड़तोड़के लिए भी उत्तरदायी हैं , जो सिग्नल ट्रांसडक्शन के अध्ययन और जैव रासायनिक विश्लेषण 21 ,22,23के अध्ययन मेंलाभान्वितहोती हैं ।
रेटिना शोधकर्ताओं ने शंकु कोशिका रेखा 661W24 , 25,26के उपयोग के रूप में वैकल्पिक तरीके विकसित किएहैं। फिर भी, इस सेल लाइन की पहचान विवादास्पद बनी हुई है,28. 661W कोशिकाओं को एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन के रेटिना ट्यूमर से क्लोन किया गया था जो मानव इंटरफोटोरिसेप्टर रेटिनोल-बाध्यकारी प्रोटीन प्रमोटर के नियंत्रण में एसवी 40 बड़े टी एंटीजन को व्यक्त करता है। SV40 बड़े टी एंटीजन सेलुलर परिवर्तन और अमरीकरण मध्यस्थता। परिणाम के रूप में, 661W कोशिकाओं का उपयोग करके पहचाने गए सिग्नलिंग मार्ग को एक रूपांतरित और अमर कोशिका रेखा के संदर्भ में सूचित किया जाना चाहिए जो सीटू में शंकु से कई मायनों में अलग है। इस संबंध में, शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली प्राथमिक न्यूरॉन्स से बना है, शंकु जो अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं।
हालांकि माउस रेटिना के वाइब्रेटम सेक्शनिंग का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर की शुद्ध संस्कृति प्राप्त करना संभव है, कृंतक के बाहरी रेटिना में शंकु का बहुत कम प्रतिशत इस दृष्टिकोण को शंकु-समृद्ध संस्कृतियों के उत्पादन के लिए अनुपयुक्त बनाता है29। सुअर रेटिना में कोई फोवी नहीं होता है लेकिन इसमें क्षेत्र केंद्री नामक क्षेत्र होता है जोशंकु 30में बहुत समृद्ध होता है । रेटिना दैनिक कृंतक में शंकु का उच्च अनुपात, अरविकांइस एन्सोर्जी और पमोमियस ऑब्सस31, 32के रूप में, एक संभावित समाधान प्रदान करता है, लेकिन ऐसी विदेशी प्रजातियों के प्रजनन की आवश्यकता होती है। स्थानीय बूचड़खानों से एकत्र वयस्क सुअर आंखों का उपयोग छड़ और शंकु की मिश्रित संस्कृति का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है जिसका उपयोग फोटोरिसेप्टर अस्तित्व33का अध्ययन करने के लिए किया गया है। एक सुरुचिपूर्ण समाधान मूंगफली एग्लुटिनिन (पीएनए) लेक्टिन के साथ पैनिंग का उपयोग करके सुअर रेटिना से शंकु को पूर्व-शुद्ध करना है, जो चुनिंदाशंकु 34को बांधता है। इसके बावजूद इस विधि को अपनी जटिलता के कारण बड़े पैमाने पर लागू करना मुश्किल है।
मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) एक शंकु फोटोरिसेप्टर सेल आबादी है कि रेटिना प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी शंकु समृद्ध संस्कृति३५,३६के लिए अनुकूलित किया जा सकता है प्राप्त करने के लिए सबसे आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है । चूंकि छड़ी-फोटोरिसेप्टर्स37के लिए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एनआरएल की आवश्यकता होती है, इसलिए एनआरएल-/-माउस में शॉर्ट वेव शंकु (एस-शंकु) का प्रभुत्व है। निष्क्रियता का उपयोग आईपीएस38, 39से मानव के विभेदन द्वारा एस-शंकु-समृद्ध तैयारी का उत्पादन करने के लिए किया जासकताहै। एक अन्य संभव दृष्टिकोण थायराइड हार्मोन सिग्नलिंग40का उपयोग करके शंकु भेदभाव को बढ़ावा देना है। जबकि मानव आईपीएस से शंकु समृद्ध संस्कृतियों के उत्पादन के लिए उपन्यास विधियां उभर रही हैं, चिकन भ्रूण एक वर्तमान सिद्ध विधि19प्रदान करते हैं ।
शंकु समृद्ध संस्कृति19अभिव्यक्ति क्लोनिंग द्वारा RdCVF की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी । इस प्रणाली का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया कि आरडीसीवीएफ 22 एरोबिक ग्लाइकोलिसिस22द्वारा ग्लूकोज तेज और उसके चयापचय को उत्तेजित करता है । इसके अलावा शंकु-समृद्ध संस्कृति का उपयोग एनएक्सएनएल1 जीन23के दूसरे उत्पाद आरडीसीवीएफएल की सुरक्षात्मक भूमिका को मान्य करने के लिए किया गया था। हाल ही में, इस प्रणाली का उपयोग ओटीएक्स 241के साथ स्थानांतरित रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा स्रावित अणुओं की रक्षा के अस्तित्व को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था।
कई मापदंडों है कि चिकन भ्रूण से एक शंकु समृद्ध संस्कृति के उत्पादन को सीमित हो सकता है में, पहला महत्वपूर्ण कदम के लिए सही रची अंडे में भ्रूण के विकास के चरण की पहचान है । यह देखा गया है कि ED8 (34वें चरण) में भ्रूण के रेटिना से कोशिकाओं की संस्कृति केवल 35% फोटोरिसेप्टर पैदा करती है, शेष 65% अन्य न्यूरॉन्स4से बने होते हैं। जो कुछ भी रसद रची अंडे पाने के लिए लागू किया, यह ठीक करने के लिए आवश्यक है तापमान और इनक्यूबेशन समय धुन, और ध्यान से भ्रूण की जांच के रूप में विकास के सभी चरणों के संदर्भ चित्रों की तुलना में४२,४५।
मूल रूप से, शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली को व्हाइट लेगहॉर्नस्ट्रेन 4का उपयोग करके विकसित किया गया था। उस तनाव के अंडों का सफेद रंग फ्रांस में विशेष रूप से सराहना नहीं की जाती है, इसलिए हमने चिकन के एक तनाव का उपयोग किया जो भूरे रंग के अंडे का उत्पादन करता है। हम मैं 657 तनाव है, जो JA57 मुर्गियां 5 के साथ मैं 66 मुर्गा पार करके कियाजाताहै का उपयोग किया. हम मूल संस्कृतियों की विशेषताओं को पुन: पेश करने में सक्षम थे। इससे पता चलता है कि चिकन की आनुवंशिक पृष्ठभूमि शंकु-समृद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।
हमने संस्कृति माध्यम में पूरक के व्यक्तिगत निष्कासन के प्रभाव का परीक्षण नहीं किया है, लेकिन यह देखा है कि इंसुलिन आरडी1 माउस में शंकु के अस्तित्व पर इंसुलिन के प्रभाव के अनुसार एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो ऑटोसोमल अप्रभावी आरपी46का एक मॉडल है। त्रियोडोथाइरोनिन (टी 3) विकास40के दौरान रेटिना सेल भाग्य में थायराइड हार्मोन रिसेप्टर की भूमिका के अनुसार चिकन भ्रूण की रेटिना अग्रदूत कोशिकाओं के भेदभाव में भी भाग ले सकता है। नतीजतन, शंकु समृद्ध संस्कृति प्रणाली४६क्लोनिंग द्वारा इंसुलिन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है ।
शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली प्राथमिक न्यूरॉन्स की संस्कृति पर निर्भर करती है और यह कोशिका रेखा 661W24, 25, 26के रूप में अमर कोशिकाओं के उपयोग पर निर्भर हैऔरअधिक उपयुक्त था विधियां हैं।
यहां वर्णित विधि को प्लाज्मिड डीएनए20के साथ पूर्व विद्युत प्रवयन करके संशोधित किया जा सकता है । रेटिना सेल निलंबन तैयार करने से पहले, पूरे रेटिना को कस्टम-निर्मित इलेक्ट्रोपोरेटर के कक्ष में रखा जाता है जिसमें 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएमएम ईडीटीए में प्लाज्मिड डीएनए के 0.5 माइक्रोन/माइक्रोन के 120 माइक्रोन के साथ रखा जाता है। 50 एमएस के लिए 15 वी की पांच दालें 950 एमएस अंतराल22से अलग होती हैं । कोन-समृद्ध संस्कृतियों में प्रतिकृति सक्षम एवियन स्प्लिस (आरसीएएएस) रेट्रोवायरस का उपयोग करके हस्तक्षेप आरएनए (आरएनएआई) देने के प्रयास असफल47थे। यह निश्चित रूप से इस तथ्य के कारण है कि सीरम की अनुपस्थिति में और कम घनत्व की संस्कृतियों में, रेटिना अग्रदूत कोशिकाएं प्रतिकृति नहीं हैं, रेट्रोवायरस के प्रचार के लिए एक अपेक्षित है।
हमने ट्रॉफिक कारकों की पहचान करने के लिए शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो अभिव्यक्ति क्लोनिंग19का उपयोग करके शंकु के अस्तित्व को बढ़ावा देती है। इसे व्यवहार्य बनाने के लिए, हमने 100 क्लोन के पूल से वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करके उच्च सामग्री स्क्रीनिंग का पहला कदम किया। यहां तक कि अगर पुस्तकालय से सीडीएनए COS-1 कोशिकाओं के ट्रांसफैक्शन के बाद एक मजबूत सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किए जाते हैं, तो यह एक गारंटी प्रदान नहीं करता है कि व्यक्तिगत सीडीएनए द्वारा एन्कोड किए गए सभी प्रोटीन व्यवहार्यता परख द्वारा सकारात्मक बनाए जाने के लिए पर्याप्त एकाग्रता तक पहुंचते हैं। यह एक बड़ी सीमा है । इस अर्थ में, किसी भी स्क्रीनिंग वास्तव में संपूर्ण नहीं है । इसके अलावा, भले ही वातानुकूलित माध्यम से झिल्लीदार प्रोटीन को नहीं हटाया गया हो, लेकिन परख का विन्यास गैर-विसारक कारकों की पहचान के लिए प्रतिकूल है। एक विकल्प के लिए सीडीएनए के अनुक्रम प्राप्त करने के बाद व्यक्तिगत क्लोन स्क्रीन के लिए कई बार एक ही उंमीदवार प्रोटीन परख में दोहराव से बचने के लिए किया जाएगा । यह रेटिना सीडीएनए पुस्तकालयों हम43इस्तेमाल अनुक्रमण द्वारा शुरू किया गया था. तर्कसंगत रहते हुए इस दृष्टिकोण की भी अपनी सीमाएं हैं । सीडीएनए दृश्यों का जैव सूचना विश्लेषण अपरिवर्तनीयता में कमी के अलावा, ज्ञान के आधार पर कुछ क्लोन स्क्रीनिंग की प्राथमिकता को अनूठा रूप से लागू करेगा। यह हानिकारक नहीं होगा अगर अंत में, पूरी लाइब्रेरी की जांच की जाएगी, भले ही ऐसा करने के लिए आवश्यक समय काफी लंबा हो जाएगा। लेकिन निरपवाद रूप से, अनुक्रम की पहचान परिणामों को देखने के हमारे तरीके को प्रभावित करेगी। यह तटस्थ नहीं होगा क्योंकि अनुक्रम की व्याख्या स्वाभाविक रूप से प्रायोगिक आंकड़ों के साथ प्रतिस्पर्धा में होगी ।
एडसीवीएफ की पहचान से यह भी पता चलता है कि उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में तकनीकी सीमाएं आवश्यक हैं । स्क्रीनिंग के पहले दौर से, हम उच्च गतिविधि(अनुपूरक चित्रा 1)के साथ दो पूल की पहचान की । पूल 0073 ने ईडीसीवीएफ की सफल पहचान की, जबकि पूल 0080 ने इस तरह की खोज का संचालन नहीं किया। हमने उस समस्या का समाधान नहीं किया है जो उप-पूल तैयार करने के दौरान सक्रिय क्लोन के नुकसान से परिणाम दे सकती है। वैकल्पिक रूप से, इसे बाहर नहीं रखा गया है, भले ही सांख्यिकीय रूप से अनुकूल न हो, कि पूल 0080 के सीडीएनए के बीच, दो प्रोटीन सहक्रियात्मक रूप से कार्य कर रहे थे और उनकी गतिविधि को व्यक्तिगत क्लोन के रूप में नहीं देखा जा सकता था।
छोटे अणुओं की स्क्रीनिंग द्वारा शंकु की रक्षा करने वाले अणुओं की पहचान शंकु-समृद्ध संस्कृति प्रणाली का भविष्य का अनुप्रयोग है । ऐसे अणु रेटिना विकृतियों के उपचार के लिए अमूल्य होंगे जिनके लिए जीन थेरेपी उम्र से संबंधित मैकुलर अध: पतन के रूप में सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण नहीं है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक जैक्स बेलालो, लोरलेई फोरनियर, इमैनुएल क्लेरिन, फ्रेडेरिक गोरा और एंट्रेप्राइज एग्रीकोल ए रेस्पॉन्साबिलिटे लिमिटी (अर्ल मोर्इज़ौ खतरों, फ्रांस) को उनकी अमूल्य मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को इन्सेर्म, सोरबोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, एग्नेस नेशनल डालना ला रेचेचे (एएनआर, लेटेक्स लाइफसेंस), फाउंडेशन फाइटिंग ब्लाइंडनेस (यूएसए) और आईएचयू एफओरेसी [एएनआर-18-आईएएचयू-0001] ने इन्वेस्टिसमेंट्स डी एवेनिर प्रोग्राम के भीतर एएनआर द्वारा प्रबंधित फ्रांसीसी राज्य फंड द्वारा समर्थित किया था।
96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) | Corning | 3603 | |
Calcein AM | Thermo-Fisher scientific | C1430 | |
CCD Camera | Photometrics | CoolSnap FX HQ | |
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | C0256 | |
CO2 Independant | Thermo-Fisher scientific | 18045-054 | |
Curved forceps | Dutscher | 005093 | |
DMEM Media | Thermo-Fisher scientific | 41966-029 | |
DNAse | Sigma-Aldrich | D4263 | |
Eggs incubator | FarmLine | M08 01 3100 | |
Ethidium Homodimer | Thermo-Fisher scientific | E1169 | |
Fœtal bovine serum | Thermo-Fisher scientific | 10270-098 | |
Gentamycin | Thermo-Fisher scientific | 15710-049 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0880 | |
ITS (insulin Transferine selenium) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
large straight pliers | Dutscher | 005074 | |
Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L8384 | |
M199 medium | Thermo-Fisher scientific | 31150-022 | |
Metamorph software | Metamorph | ||
Microscope | NIKON | Eclipse TE2000 | |
Motorized stage | Martzauzer | Mutlicontrol 2000 | |
Optical filter switch | Shutter Instrument company | Lambda 10-2 | |
PBS 1X | Thermo-Fisher scientific | 14190-086 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
Pursept A express | Fisher scientific | 11814110 | |
Putriscine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
straight forceps | Dutscher | 005092 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Trypan blue | Thermo-Fisher scientific | 15250-061 | |
Trypsine 0.25 % | Thermo-Fisher scientific | 25200-056 |