एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम का उपयोग कर मानव स्तन ऊतक में स्तन कैंसर मॉडलिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल शेल्फ सामग्री के साथ प्राथमिक मानव स्तन ऊतक का उपयोग करके स्तन कैंसर का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम के निर्माण का वर्णन करता है।
Abstract
स्तन कैंसर (बीसी) महिलाओं के लिए मौत का एक प्रमुख कारण बना हुआ है । सालाना बीसी अनुसंधान में $ 700 मिलियन से अधिक निवेश के बावजूद, 97% उम्मीदवार बीसी दवाएं नैदानिक परीक्षणों में विफल हो जाती हैं। इसलिए, रोग के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए नए मॉडलों की जरूरत है । NIH माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम्स (एमपीएस) कार्यक्रम बुनियादी विज्ञान खोजों के नैदानिक अनुवाद में सुधार और नई चिकित्सीय रणनीतियों का वादा करने के लिए विकसित किया गया था । यहां हम स्तन कैंसर (बीसी-एमपीएस) के लिए एमपीएस पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल आदिपोस-व्युत्पन्न स्टेम सेल शीट्स (एएससी) एस के बीच वाट सैंडविचिंग द्वारा प्राथमिक मानव सफेद एडीपोज ऊतक (वाट) को बनाने के पहले वर्णित दृष्टिकोण को अनुकूलित करता है। हमारे बीसी-एमपीएस के उपन्यास पहलुओं में बीसी कोशिकाओं को गैर-रोगग्रस्त मानव स्तन ऊतक (एचबीटी) में सीडिंग करना शामिल है जिसमें देशी एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स, परिपक्व एडिपोसाइट्स, निवासी फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं; और एचबीटी-व्युत्पन्न एएससी शीट्स के बीच बीसी-एचबीटी मिश्रण सैंडविचिंग । जिसके परिणामस्वरूप बीसी-एमपीएस संस्कृति पूर्व वीवो में कम से 14 दिनों के लिए स्थिर है । इस मॉडल प्रणाली में माइक्रोएनवायरमेंट के कई तत्व होते हैं जो ईसा पूर्व को प्रभावित करते हैं जिसमें एडिपोसाइट्स, स्ट्रोमल कोशिकाएं, प्रतिरक्षा कोशिकाएं और बाह्य कोशिकाएं शामिल हैं। इस प्रकार बीसी-एमपीएस का उपयोग बीसी और इसके माइक्रोएनवायरमेंट के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
हम कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस को प्रभावित करने के लिए जाने जाने वाले दो बीसी व्यवहारों का अध्ययन करके अपने बीसी-एमपीएस के फायदों को प्रदर्शित करते हैं: 1) बीसी मोटिविटी और 2) बीसी-एचबीटी मेटाबोलिक क्रॉसटॉक। जबकि बीसी मोटिविटी को पहले इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है, बीसी-एमपीएस कई दिनों में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, जब मेटाबोलिक क्रॉसटॉक को पहले बीसी कोशिकाओं और मुरीन प्री-एडिपोसाइट्स का उपयोग करके अपरिपक्व एडीपोसाइट्स में विभेदित किया गया था, तो हमारा बीसी-एमपीएस मॉडल प्राथमिक मानव स्तन एडिपोसाइट्स और विट्रो में बीसी कोशिकाओं के बीच इस क्रॉसटॉक को प्रदर्शित करने वाली पहली प्रणाली है।
Introduction
हर साल, ४०,० से अधिक अमेरिकी महिलाओं को स्तन कैंसर (ईसा पूर्व)1से मर जाते हैं । सालाना बीसी अनुसंधान में $ 700 मिलियन से अधिक निवेश के बावजूद, 97% उम्मीदवार बीसी ड्रग्स नैदानिक परीक्षणों में विफल रहते हैं2,3। दवा विकास पाइपलाइन और बीसी की हमारी समझ में सुधार करने के लिए नए मॉडलों की जरूरत है । एनआईएच माइक्रोफिजियोलॉजिकल (एमपीएस) कार्यक्रम ने बुनियादी विज्ञान को नैदानिक सफलता4में अनुवाद में सुधार के लिए सफलता मॉडल के लिए आवश्यक सुविधाओं को चित्रित किया । इनमें प्राथमिक मानव कोशिकाओं या ऊतकों का उपयोग, 4 सप्ताह के लिए संस्कृति में स्थिर, और देशी ऊतक वास्तुकला और शारीरिक प्रतिक्रिया को शामिल करना शामिल था।
वर्तमान इन विट्रो बीसी मॉडल, जैसे बीसी सेल लाइनों की दो-आयामी संस्कृति, झिल्ली सम्मिलित सह-संस्कृति, और त्रि-आयामी स्फेरॉइड और ऑर्गेनॉइड, एनआईएच के एमपीएस मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं क्योंकि इनमें से कोई भी देशी स्तन ऊतक वास्तुकला को फिर से नहीं बनाता है। जब इन प्रणालियों में एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) जोड़ा जाता है, तो स्तन ईसीएम का उपयोग नहीं किया जाता है; इसके बजाय, कोलेजन जैल और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिस का उपयोग किया जाता है।
वीवो सिस्टम में वर्तमान, जैसे रोगी व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स), इसी तरह एनआईएच के एमपीएस मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं क्योंकि मुरीन स्तन ऊतक मानव स्तनों से काफी भिन्न होते हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रणाली-ईसा पूर्व बातचीत तेजी से ट्यूमर के विकास में महत्वपूर्ण के रूप में मांयता प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन PDX ट्यूमर पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया इम्यूनोसमझौता मुरीन मॉडल परिपक्व टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं की कमी है । इसके अलावा, जबकि पीडीएक्स प्राथमिक स्तन ट्यूमर को बनाए रखने और विस्तारित करने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप पीडीएक्स ट्यूमर प्राथमिक मुरीन स्ट्रोमल कोशिकाओं और ईसीएम5के साथ घुसपैठ कर रहे हैं।
इन चुनौतियों से उबरने के लिए हमने एक उपन्यास, पूर्व वीवो, त्रि-आयामी मानव स्तन सांसदों का विकास किया है जो एनआईएच एमपीएस मानदंडों को पूरा करता है । हमारे स्तन सांसदों की नींव आदिपोस-व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASCs) की दो चादरों के बीच प्राथमिक मानव स्तन ऊतक (एचबीटी) सैंडविचिंग द्वारा बनाई गई है, यह भीHBT (चित्रा 1)से अलग । सेल शीट्स को सैंडविच में स्थानांतरित करने के लिए प्लंपर्स एचबीटी 3 डी मुद्रित या सरल ऐक्रेलिक प्लास्टिक(चित्रा 1H,I) से बनाया जा सकताहै। यह तकनीक प्राथमिक मानव सफेद आदिपोसाइट ऊतक6,7को बनाने के लिए हमारे पहले वर्णित दृष्टिकोण को अनुकूलित करती है । स्तन सांसदों तो पसंद के एक बीसी मॉडल द्वारा वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, मानक बीसी सेल लाइनों से प्राथमिक मानव स्तन ट्यूमर को लेकर । यहां, हम बताते हैं कि ये बीसी-एमपीएस कई हफ्तों के लिए संस्कृति में स्थिर हैं(चित्र 2); एचबीटी के मूल तत्वों जैसे स्तन एडीपोसाइट्स, ईसीएम, एंडोथेलियम, प्रतिरक्षा कोशिकाएं(चित्र 3);शामिल करें; और बीसी और एचबीटी जैसे मेटाबोलिक क्रॉसटॉक(चित्रा 4)के बीच शारीरिक बातचीत को फिर से बढ़ाएं । अंत में, हम बताते हैं कि बीसी-एमपीएस पूरेएचबीटी (चित्रा 5)में बीसी कोशिकाओं के अमीबाइड आंदोलन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव स्तन कैंसर मॉडलिंग के लिए नई प्रणालियों की जरूरत है रोग की एक बेहतर समझ विकसित करने के लिए । मानव माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम का मॉडल रोग सेटिंग्स में विकास जिसमें देशी ईसीएम और स्ट्रोमल कोशिकाए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ट्यूलेन फ्लो साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर के साथ-साथ तुलेन हिस्टोलॉजी कोर को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को साउथईस्टर्न सोसाइटी ऑफ प्लास्टिक एंड रिकंटेनिव सर्जन्स 2019 रिसर्च ग्रांट और नेशनल साइंस फाउंडेशन (ईपीएसकोआर ट्रैक 2 आरआईआई, ओआईए 1632854) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
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