荧光泄漏实验是一种简单的方法，可用于研究肽与膜之间的相互作用，以了解其在多种生物过程中的作用，特别是细胞穿透肽在直接跨细胞转位过程中扰动磷脂双分子层的能力。
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本文内容
摘要
摘要
细胞穿膜肽（CPPs）是指能够穿过质膜并将货物分子转运入细胞的载体。实现这一功能所需的主要共同特征之一源于CPPs与质膜（脂质）以及更特异地与膜自身细胞外基质组分（硫酸乙酰肝素）之间的相互作用。事实上，无论通过直接转位还是内吞依赖性内化途径，脂质双分子层均参与了内化过程，这不仅发生在质膜水平，也涉及细胞内运输过程（如内体囊泡）。本文提供了一项详细实验方案，描述了大单层囊泡（LUVs）的制备、纯化、表征及其在荧光泄漏实验中的应用，以检测CPP与膜之间可能发生的去稳定作用或相互作用，并探讨其在内化机制中的作用。通过构建脂质组成模拟质膜的LUVs，包封荧光染料和淬灭剂。将肽段加入囊泡外环境后，肽与LUV膜的相互作用可能以剂量依赖的方式诱导荧光显著增强，从而反映内容物的泄漏。本文以近期开发的富含色氨酸（W）和精氨酸（R）的两亲性肽（WRAPs）为例进行说明，该类肽在多种细胞系中表现出快速且高效的siRNA递送能力。最后，本文讨论了这些相互作用的本质及其对脂质的亲和力，以期深入理解并优化膜转位及/或内体逃逸过程。
引言
20世纪90年代被发现后，细胞穿透肽（CPPs）被开发用于促进货物分子通过质膜实现高效的细胞内递送1,2。CPPs通常是短肽，一般由8至30个氨基酸组成，来源多样。它们最初被定义为"直接转位"载体，意指其能够独立于任何内吞途径、无需能量供应或受体参与，直接穿过质膜并将货物分子转运入细胞。然而，后续研究表明，这些早期观察结果主要源于实验伪影或使用甲醇固定所导致的荧光信号高估3。目前普遍认为，CPP的摄取机制既包括内吞作用，也包括非能量依赖性的转位过程4,5,6,7，具体途径取决于多种参数，如货物的性质、CPP与货物之间的连接方式、所研究的细胞系等。
CPP 可根据两种策略用作转染试剂：一种是 CPP 与其货物之间通过化学键（共价策略）连接，另一种是通过静电作用/疏水相互作用（非共价策略）8,9,
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方案
1. 大单层囊泡（LUVs）的制备
- 制备大单层囊泡（LUVs），用于作为细胞膜模拟物进行荧光泄漏实验。
- 使用 Hamilton 玻璃注射器，按 4:4:2 的摩尔比混合磷脂酰胆碱（DOPC，786.11 g/mol）、鞘磷脂（SM，760.22 g/mol）和胆固醇（Chol，386.65 g/mol）。脂质溶液由每种脂质在甲醇/氯仿（3/1，体积/体积）溶剂中的储备液配制而成，储备液浓度为 25 mg/mL，置于 25 mL 玻璃圆底烧瓶中。根据 4 µmol DOPC、4 µmol SM 和 2 µmol Chol 的用量，分别取储备液 126 µL、117 µL 和 31 µL 混合得到所需脂质溶液。
警告：甲醇为有毒且易燃的溶剂，氯仿具有毒性并可能致癌。两者均应在通风橱内佩戴适当防护装备操作。 - 在 60 °C 条件下，使用旋转蒸发仪在减压环境中蒸发甲醇/氯仿，持续 45–60 分钟，直至形成干燥的脂质薄膜。
- 配制两种 HEPES 缓冲液储备液。HEPES 缓冲液 1 的配制方法为：混合 20 mM HEPES（238.3 g/mol）和 75 mM NaCl（58.44 g/mol），调节 pH 至 7.4。HEPES 缓冲液 2 的配制方法为：混合 20 mM HEPES 和 145 mM NaCl，调节 pH 至 7.4。HEPES 缓冲液可在 4 °C 下保存 1 个月。
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结果
荧光泄漏实验的原理如图1所示。具体而言，将包裹有荧光染料和淬灭剂（无荧光信号）的大单层囊泡（LUVs）与目标生物分子共同孵育。由于肽与脂质膜相互作用，可能导致膜通透性增加、结构重排甚至破裂，荧光染料和淬灭剂因而从LUVs中释放出来。在缓冲液中进一步稀释后，荧光信号增强。
尽管本方案展示了使用游离肽进行的测试，但该系统的优势在于还能够检测可能破坏脂质膜的肽偶联物、基于肽的纳米颗粒或其他生物大分子。尽管在测试分子方面需要对实验方案进行初步优化，但这种荧光泄漏检测法可扩展应用于大量与膜相互作用的组分。在本实验方案中，我们展示了细胞穿透肽（CPPs）及其复合形式（非共价策略）或偶联形式（共价策略）的一些实验结果。以下示例包括单独使用的WRAP、负载siRNA的WRAP基纳米颗粒，以及两种不同的肽偶联物（WRAP-iCAL3617 和 Penetratin.......
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讨论
本文介绍的荧光泄漏实验是一种简单且快速的方法，用于评估穿膜肽对膜稳定性的破坏作用。该方法操作简便，还可实现不同膜相互作用肽或其他膜相互作用分子之间的间接比较。关于实验方案中的关键步骤，由于该实验通过比较基础值（仅LUVs）与最大荧光释放量（Triton处理条件）来提供相对数值，我们通常使用磷脂定量试剂盒测定LUVs浓度，但该方法仅能估算LUVs中胆碱成分的贡献。然而，也可通过酸消化法测定总磷含量（如Rouser及其同事27或Bartlett28所述），或采用硫酸铁铵硫氰酸盐比色法与磷脂形成络合物进行更精确的LUV 浓度测定29。据我们经验，这些方法对泄漏的相对定量以及膜相互作用肽之间的比较结果并无显著影响。
关于LUV的使用，还应注意控制LUV自身基线状态的重要性，以检查其是否可用，以及是否已出现泄漏（表现为荧光持续增加）。同样，在每次肽孵育后测量最大荧光释放量也至关重要，以确保未因非预期的淬灭过程（例如肽/染料淬灭）而记录到假阴.......
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致谢
作者感谢Emilie Josse对稿件的审阅。本研究得到了"La Ligue contre le Cancer"基金会、"Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer"以及"Centre National de la Recherche Scientifique"（CNRS）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 mL 玻璃圆底烧瓶 | Pyrex | ||
| 8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐（ANTS） | Invitrogen | A350 | 避光保存 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC（二油酰基磷脂酰胆碱） | Avanti Polar | 850375P | 避免接触空气 |
| 挤出器 | Avanti Polar | 610000 | |
| 荧光分光光度计 | PTI Serlabo | ||
| 50 µL 玻璃注射器 | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay 磷脂检测试剂盒 | WAKO | 296-63801 | |
| 液相色谱柱 | Sigma-Aldrich | ||
| 甲醇 | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore 聚碳酸酯膜（孔径 0.1 µm，直径 25 mm） | Whatman | 800309 | |
| 聚苯乙烯比色皿，10 × 10 × 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| 聚苯乙烯半微量比色皿，用于动态光散射（DLS） | Fisher Scientific | FB55924 | |
| 对二甲苯双吡啶溴化物（DPX） | Invitrogen | X1525 | 避光保存 |
| 石英荧光比色皿 | Hellma | 109.004F-QS | |
| 旋转蒸发系统 | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 树脂 | Amersham | 17-0042-01 | |
| 叠氮化钠（NaN3） | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 超声波清洗仪 USC300T | VWR | 142-6001 | |
| 鞘磷脂 | Avanti Polar | 860062P | 避免接触空气 |
| 吐温 X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetasizer NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
参考文献
- Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005). ....
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重印与许可
