Estimering av krystallinsk celluloseinnhold av plantebiomasse ved hjelp av Updegraff-metoden

Summary

Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Hovedformålet med denne demonstrasjonen er å gi en detaljert Updegraff-protokoll for estimering av celluloseinnhold i plantebiomasseprøver.

Abstract

Cellulose er den mest tallrike polymeren på jorden generert av fotosyntese og den viktigste bærende komponenten av cellevegger. Celleveggen spiller en viktig rolle i plantevekst og utvikling ved å gi styrke, stivhet, hastighet og retning av cellevekst, vedlikehold av celleformer og beskyttelse mot biotiske og abiotiske stressfaktorer. Celleveggen består hovedsakelig av cellulose, lignin, hemicellulose og pektin. Nylig har plantecellevegger blitt målrettet for andre generasjons biodrivstoff- og bioenergiproduksjon. Spesielt brukes cellulosekomponenten til plantecelleveggen til produksjon av cellulosisk etanol. Estimering av celluloseinnhold i biomasse er avgjørende for grunnleggende og anvendt celleveggforskning. Updegraff-metoden er enkel, robust og den mest brukte metoden for estimering av krystallinsk celluloseinnhold av plantebiomasse. Den alkoholløselige råcelleveggfraksjonen ved behandling med Updegraff-reagens eliminerer hemicellulose- og ligninfraksjonene. Senere blir Updegraff reagensresistent cellulosefraksjon utsatt for svovelsyrebehandling for å hydrolysere cellulose homopolymeren i monomeriske glukoseenheter. En regresjonslinje er utviklet ved hjelp av ulike konsentrasjoner av glukose og brukes til å estimere mengden glukose som frigjøres ved cellulosehydrolyse i eksperimentelle prøver. Til slutt er celluloseinnholdet estimert basert på mengden glukosemonomerer ved kolorimetrisk antronanalyse.

Introduction

Cellulose er den primære bærende komponenten av cellevegger, som finnes i både primære og sekundære cellevegger. Celleveggen er en ekstracellulær matrise som omgir planteceller og hovedsakelig består av cellulose, lignin, hemicellulose, pektin og matriseproteiner. Omtrent en tredjedel av plantene biomasse er cellulose¹ og det spiller betydelige roller i plantevekst og utvikling ved å gi styrke, stivhet, hastighet og retning av cellevekst, vedlikehold av celleform og beskyttelse mot biotiske og abiotiske stressfaktorer. Bomullsfiber inneholder 95% cellulose² innhold, mens trær inneholder 40% til 50% av cellulose avhengig av plantearter og organtyper³. Cellulosen består av gjentatte enheter av cellobiose, et disakkarid av glukoserester forbundet med β-1,4 glykosidiske bindinger⁴. Cellulosisk etanol produseres fra glukose avledet fra cellulosen som er tilstede i plantecelleveggene⁵. Cellulosisk fiber består av flere mikrofibriler der hver mikrofibril fungerer som kjerneenhet med 500-15000 glukosemonomerer^1,6. Cellulose homopolymer syntetiseres av plasmamembran innebygde cellulosesyntasekomplekser (CSC)^1,7. Individuelle cellulosesyntase A (CESA) proteiner syntetiserer glukankjeder og de tilstøtende glukankjedene er forbundet med hydrogenbindinger for å danne krystallinsk cellulose^1,8. Cellulose finnes i flere krystallinske former med to dominerende former, cellulose Iα og cellulose Iβ som opprinnelige former⁹. I høyere planter finnes cellulose i cellulose Iβ-form mens lavere plantecellulose eksisterer i Iα form^10,11. Totalt sett spiller cellulosen en betydelig rolle i å gi styrke og stivhet til plantecelleveggene.

Første generasjons biodrivstoff produseres hovedsakelig fra maisstivelse, sukkerrør og betesukker, som er matkilder, mens andre generasjons biodrivstoff fokuserer på biodrivstoffproduksjonen fra biomassemateriale fra ikke-matplantebiomassecelleveggmateriale¹². Nøyaktig estimering av krystallinsk celluloseinnhold er ikke bare viktig for grunnleggende forskning på cellulosebiosyntese og celleveggdynamikk, men også for anvendt biodrivstoff- og bioproduktforskning. Ulike metoder er utviklet og optimalisert for estimering av cellulose i plantebiomassen, og Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Den første rapporterte metoden for celluloseestimering var av Cross og Bevan i 1908¹³. Metoden var basert på prinsippet om alternativ klorering og ekstraksjon ved natriumsulfat. Cellulosen oppnådd av den opprinnelige så vel som modifiserte protokoller av Cross og Bevan-metoden viste imidlertid forurensning av små brøkdeler av lignin i tillegg til en betydelig mengde xylans og mannans¹⁴. Til tross for flere modifikasjoner for å fjerne lignin og hemicelluloses fra cellulosefraksjonen, beholdt Cross-Bevan-metoden en betydelig mengde mannans sammen med cellulose. Senere ble Kurschners metode utviklet ved å bruke salpetersyre og etanol for å trekke ut cellulose¹⁵. Denne metoden uttalte at total lignin og 75% av pentosanene ble fjernet, men de sanne celluloseresultatene var de samme som de som ble estimert ved kloreringsmetoden Cross og Bevan. En annen metode (Norman og Jenkins) ble utviklet ved å bruke metanol-benzen, natriumsulfat og natriumhypokloritt for å trekke ut cellulose¹⁶. Denne metoden beholdt også en brøkdel av lignin (3%) og betydelige mengder pentosaner som fører til nøyaktig estimering av cellulose. Senere brukte Kiesel og Semiganowsky en annen tilnærming til hydrolysert cellulose ved hjelp av 80% konsentrert svovelsyre, og de hydrolyserte reduserte sukkerene ble estimert av Bertrands metode¹⁷. De to metodene, Waksman’s og Stevens¹⁸ og Salo^14,19 som ble utviklet basert på Kiesel og Semiganowskys metode, ga også 4-5% mindre celluloseinnhold sammenlignet med tidligere metoder²⁰.

Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Denne metoden ble først beskrevet av Updegraff for måling av cellulose i 1969²¹. Updegraff-metoden integrerer Kurschner-metoden (bruk av salpetersyre), Kiesel- og Seminowsky-metoder (hydrolyse av cellulose i glukosemonomerer ved hjelp av svovelsyre) med noen modifikasjoner, og antronanalysen av Viles og Silverman for enkel kolorimetrisk estimering av glukose og krystallinsk celluloseinnhold²². Prinsippet for denne metoden er bruk av eddiksyre og salpetersyre (Updegraff reagens) for å eliminere hemicellulose og lignin fra det homogeniserte plantevevet, som etterlater eddiksyre / salpetersyreresistent cellulose for videre behandling og estimering¹⁵. Den eddiksyreresistente cellulosen behandles med 67% svovelsyre for å bryte cellulosen i glukosemonomerer, og de frigjorte glukosemonomerene er estimert av antronanalyse^21,23. Flere modifikasjoner av den opprinnelige Updegraff-metoden ble brukt til å forenkle prosedyren og celluloseestimering ved antronanalyse²⁴. Generelt kan denne metoden deles inn i fem faser. I den første fasen fremstilles plantematerialet. I den andre fasen er råcelleveggen skilt fra den totale biomassen, da cellulose er nøkkelkomponenten i plantecellevegger. Senere, i tredje fase, er cellulosen skilt fra de ikke-cellulosecelleveggkomponentene ved behandling med Updegraff-reagens. I fjerde fase brytes den eddiksyreresistente cellulosen inn i glukosemonomerer ved svovelsyrebehandling. Svovelsyrebehandling av cellulose resulterer i dannelse av 5-hydroksymetylfurfuralforbindelser fra reaksjonen av glukosemonomerer med svovelsyre. Til slutt, i den siste fasen, genererer anthronen et grønt blått kompleks ved å koke med furfuralforbindelsen generert i forrige fase²⁵. Denne antronbaserte kolorimetriske metoden ble først brukt i 1942 av Dreywood. Anthron er et fargestoff som identifiserer furfuralforbindelser av pentose og heksose dehydrerte produkter som 5-hydroksymetylfurfural, under sure forhold. Reaksjon med heksose gir en intens farge og bedre respons sammenlignet med pentoser²⁵. Mengden bundet glukose måles ved spektrofotometerabsorbering ved 620 nm og intensiteten av det grønne blå komplekset er direkte proporsjonal med mengden sukker i prøven. De målte absorbansverdiene ble sammenlignet med en glukosestandard regresjonslinje for å beregne glukosekonsentrasjonen av prøven. Det målte glukoseinnholdet ble brukt til å estimere celluloseinnholdet i plantebiomassen.

Protocol

1. Eksperimentell forberedelse Grind tørket plantemateriale i et fint pulver. Protein Solubilization Buffer (PSB): Klargjør lagerløsninger på 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M etylendimintetraketisk syre (EDTA) (pH 8,0) og autoklaver dem. Lag fersk PSB-buffer fra disse lagerløsningene med endelige konsentrasjoner på 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA og 10% natrium dodecylsulfat (SDS) i sterilt vann. Forbered 100 ml 70% etanol (v / v): 70 ml 100% etanol og 30 ml sterilt vann. Forbered 100 ml met…

Representative Results

Bomullsplanter dyrket i det grønne huset ble valgt ut til denne studien. To forskjellige eksperimentelle linjer av bomull ble valgt for komparativ analyse av celluloseinnhold. For hver eksperimentell linje ble rotvevet samlet inn fra tre biologiske repliker. Totalt 500 mg vev ble homogenisert og 20 mg av det ble brukt til råcelleveggutvinning. Senere ble 5 mg råcellet veggekstrakt brukt til Updegraff reagensbehandling for å fjerne hemicellulose og lignin fra cellulose. Den rensede cellulosen ble hydrolysert ved svove…

Discussion

Bomullsfibre er naturlige fibre produsert av bomullsseed. Bomullsfiber er en enkelt celle med ~ 95% celluloseinnhold² med høyt krystallinsk celluloseinnhold med omfattende applikasjoner i tekstilindustrien³¹. Som, bomullsfiber inneholder ~ 95% cellulose, har vi brukt bomull rotvev for demonstrasjon av estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Bomullsrotvev er moderat rik på krystallinsk celluloseinnhold og representerer en vanlig tilgjengelig plantebiomasse. Mengden to…

Materials

Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol