يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل جهاز acoustofluidic منخفض التكلفة للتسليم الجزيئي السريع للخلايا عن طريق سونوبوبينيد الناجم عن عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تجميع وتشغيل جهاز Acoustofluidic لتعزيز تسليم المركبات الجزيئية إلى الخلايا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مطلوب تسليم فعال داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية لمجموعة واسعة من البحوث الطبية الحيوية والتطبيقات العلاجية القائمة على الخلايا. الموجات فوق الصوتية بوساطة سونوبوينج هو تقنية ناشئة للتسليم السريع داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية. يحدث التجويف عندما يشكل تجويف الفقاعات الدقيقة المملوءة بالغاز مساما عابرة في أغشية الخلايا القريبة ، مما يتيح امتصاصا سريعا للجزيئات الحيوية من السائل المحيط. التقنيات الحالية ل سونوبوبينيشن في المختبر من الخلايا في تعليق محدودة من قبل الإنتاجية البطيئة، والتباين في ظروف التعرض بالموجات فوق الصوتية لكل خلية، وارتفاع التكلفة. لمعالجة هذه القيود، تم تطوير جهاز acoustofluidic منخفض التكلفة الذي يدمج محول الموجات فوق الصوتية في جهاز السائل القائم على PDMS للحث على سونوبوديشن متسقة من الخلايا لأنها تتدفق من خلال القنوات بالاشتراك مع وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية. يتم تصنيع الجهاز باستخدام تقنيات التصوير الضوئي القياسية لإنتاج رقاقة السائل المستندة إلى PDMS. يتم إرفاق محول قرص بيزو بالموجات فوق الصوتية بالجهاز ويقوده متحكم دقيق. يمكن دمج التجميع داخل علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد لمزيد من الحماية. يتم دفع الخلايا والفقاعات الدقيقة من خلال الجهاز باستخدام مضخة حقنة أو مضخة معجبة متصلة بأنابيب PVC. ويتجلى تعزيز تسليم الجزيئات الحيوية إلى الخلايا التائية البشرية وخلايا سرطان الرئة مع هذا النظام acoustofluidic. بالمقارنة مع نهج العلاج السائبة ، يزيد هذا النظام acoustofluidic الإنتاجية ويقلل من التباين ، مما يمكن أن يحسن طرق معالجة الخلايا لتطبيقات البحوث الطبية الحيوية وتصنيع العلاجات القائمة على الخلايا.
المقدمة
وقد استخدمت منصات الفيروسية وغير الفيروسية لتعزيز التسليم الجزيئي للخلايا. التسليم الفيروسي (النقل) هو تقنية شائعة تستخدم في العلاجات القائمة على الخلايا التي تتطلب التعديل الجينومي. وتشمل القيود مع التسليم الفيروسية تولد الغرز المحتملة، والقدرة المعدلة وراثيا محدودة، وتعدد غير مرغوب فيه من العدوى1،2. لذلك ، يتم تطوير تقنيات التسليم الجزيئي غير الفيروسية لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية والبحثية. وتشمل التقنيات الشائعة الميكانيكية والكهربائية والديناميكية المائية، أو استخدام الطاقة القائمة على الليزر لتعزيز امتصاص الجزيئات الحيوية في الخلايا 3. Electroporation هو منصة توصيل جزي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم جمع تبرعات الدم الكاملة من المتبرعين الأصحاء بعد البروتوكولات التي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة لويز.
1. تصنيع الجهاز acoustofluidic
- الحصول على قناع ضوئي مع تصميم حلزوني متحد المركز يحتوي على قنوات بقطر 500 ميكرومتر. يتم توفير ملف CAD في الملفات التكميلية كمثال. يمكن طلب قناع ضوئي مخصص من بائع تجاري أو نقشه باستخدام كاتب قناع.
- إعداد قالب من تصميم حلزوني متحد المركز على رقاقة السيليكون المغلفة بحامض ضوئي باستخدام تقنيات التصوير الضوئي القياسية.
- أضف ما يقرب من 2 ملعقة كبيرة (~ 30 مل) من SU-8 2100 إلى رقاقة سيليكون 100 مم.
- تدور معطف رقاقة على الدوار بسرعة 150 دورة في الدق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تظهر صورة للنظام acoustofluidic المجمعة داخل حالة مطبوعة ثلاثية الأبعاد في الشكل 1. ينتج هذا البروتوكول نظام acoustofluidic التي يمكن استخدامها لتعزيز التسليم الجزيئي داخل الخلايا في خطوط الخلايا المتعددة باستخدام عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية.
الشكل 2 يوضح تعزيز التسليم داخل الخلايا من مركب الفلورسنت، الفلورسين، إلى الخلايا التائية البشرية الأولية مع العلاج acoustofluidic مقارنة مع مجموعة مراقبة غير المعالجة (.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل نظام acoustofluidic منخفض التكلفة الذي يعزز التسليم داخل الخلايا للجزيئات الحيوية لتطبيقات البحث. هناك العديد من العوامل الهامة التي يجب مراعاتها عند تجميع وتشغيل هذا النظام. الجهاز acoustofluidic هو ملفقة في PDMS، وهو مادة متوافقة بيولوجيا التي يمكن بسهولة مصبوب مع أبعاد قناة متسقة27. يمكن شطف قنوات الجهاز بمحلول الإيثانول 15 مل من 70٪ قبل معالجة acoustofluidic من أجل زيادة العقم عند العمل مع الخلايا المستزرعة. بعد تنظيف الإيثانول، يمكن استخدام 15 مل من الماء المتأ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يمتلك المؤلفان المشاركان MAM و JAK ملكية في DesiCorp والتي قد تستفيد ماليا من المنتجات المتعلقة بهذا البحث.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم (#1827521 #1827521 #1450370) والمعاهد الوطنية للصحة (U01HL127518). تم توفير خدمات التصوير الضوئي من قبل جامعة لويز مايكرو / نانو مركز التكنولوجيا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>تصنيع جهاز Acoustofluidic < / قوي > | |||
| DOW SYLGARD 184 مغلف سيليكون شفاف 0.5 كجم مجموعة | لاصقات إلسورث | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris أحادي النواة (2.5 مم) | علوم المجهر الإلكتروني | 69039-25 | |
| خزان الموائع الدقيقة لأنبوب الصقر سعة 15 مل - S (منفذ 2/4) | داروين Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| المجهر | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| ثلاثي كلوروسيلان | Gelest | 105732-02-3 (رقم Cas.) | الكلوروسيلان شديد الاشتعال وقابل للاشتعال. يسبب التعرض حروقا شديدة وتلفا في العين. |
| Tygon PVC أنابيب بلاستيكية ناعمة (1/16 "معرف ، 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (الجزء #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| <قوي>تجميع نظام Acoustofluidic < / قوي > | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (الباركود) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| <قوي>تحضير عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية < / قوي> | |||
| 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti | Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1،2- ديستيرويل - SN - جلسيرو -3 - فوسفوجلسرين (DSPG) | أفانتي ليبيدات | 840465 ف -25 مجم (كود المنتج) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (غاز ديكافلوروبوتات) | فلوروميد | 355-25-9 (رقم كاس) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | كوكسو | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| بولي أوكسي إيثيلين 40 ستيرات | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Q125-110 (المرجع) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r | |
| <قوي>تحضير خلايا Primarty T < / قوية > | |||
| autoMACs تعمل بالمخزن المؤقت | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (رقم الطلب) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| طقم عزل الخلايا التائية ، بشري (كوكتيل الأجسام المضادة للبيوتين من خلية التائية والبيوتين كوكتيل Pan T-Cell MicroBead) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (رقم الطلب) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| فارز الخلايا المغناطيسية (فاصل autoMACS Pro) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (رقم الطلب) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| <قوي>تحضير خلايا سرطان الرئة A549< / قوية > | |||
| مجموعة فحص تريهالوز ؛ | Megazyme | K-TREH (Cat. لا.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| أزرق تريبان (0.4٪ في محلول مائي جاهز للاستخدام ، معقم) | VWR | 97063-702 (Cat. لا.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
المراجع
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vecto....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
