此协议的目标是使用振动切除隔离小鼠肾骨盆的完整心脏起搏器区域。然后,这些部分可用于原位 Ca2+ 成像,以阐明心脏起搏器细胞和振动切片中其他间质细胞的 Ca2+ 瞬态特性。
肾骨盆 (RP) 是一种漏斗形状的光滑肌肉结构,通过定期的推进性收缩促进正常尿液从肾脏输送到输尿管。定期的RP收缩依赖于心脏起搏器活性,它源于骨盆肾结(PKJ)的RP最近区域。由于难以获得和保存PKJ的完整制剂,大多数关于RP制动的调查都集中在单细胞电生理学和Ca2+ 成像实验上。虽然这些实验在RP起搏方面已经有了重要的启示,但有几个内在的局限性,包括无法准确确定混合悬架中的细胞身份,以及RP心脏起搏器活性的缺乏就地成像。这些因素导致对正常节奏RP收缩背后的机制的理解有限。本文描述了一个协议,使用振动切除技术准备鼠标PKJ的完整片段。通过将这种方法与表达细胞特异性报告和基因编码的Ca2+ 指标相结合,研究人员或许能够更准确地研究对正常尿液运输至关重要的渗透性RP收缩的特定细胞类型和机制。
肾骨盆 (RP) 是一种漏斗状的光滑肌肉结构,将尿液从肾脏输送到输尿管。RP通过产生定期的节律收缩(腹膜收缩)1,2,3,4,5来输送尿液,从而将尿液从肾脏远射到输尿管,并最终输送到膀胱,在那里储存,直到6,7发生麦克风。失去这种正常活动有可怕的后果,包括肾上腺肿和肾衰竭1,3,8:因此,迫切需要研究定期、有节奏的RP收缩背后的机制。腹膜收缩源于RP最近的区域-在骨盆肾结(PKJ)9,10,11,12,13,14,15(图1A-C),并传播远,推动尿液从乳香草进入RP(图1B)。PKJ 记录为自发瞬态去极化 10、11、12、13、15、16、17,这些电起搏器活动被认为来自专用心脏起搏器细胞。这些心脏起搏器细胞,以前称为非典型平滑肌肉细胞(ASMCs),被认为产生或协调心脏起搏器活动,并推动收缩”典型的”平滑肌肉细胞(SMCs)9,10,11,18,19,20,21,22,23。
ASMC在PKJ(图1A-C)的近身RP中最为丰富,其中渗透收缩和电起搏器活动起源于5、7、8、9、12、13、14、16、17、18、19、20、21 ,22.该组最近发表的一项研究确定血小板衍生生长因子受体-阿尔法(PDGFR+),结合平滑肌肌素重链(smMHC),作为这些间质细胞(ICs)24的独特生物标志物,这一发现已被其他组25证实。根据它们的形态和蛋白质表达模式,这些细胞被称为PDGFR®+ IC类型1(PIC1)24,26。PIC1位于PKJ的肌肉层,在那里它们显示高频,短持续时间Ca2+瞬态,被认为是心脏起搏器潜力24生成的基础。但是,PKJ 中还存在其他细胞类型,包括冒险层中非 smMHC 表达 PDGFR®和IC (PIC2s)。此前有报道称,非mMHCIC可参与心脏起搏器活动的监管。然而,在Ca2+成像研究中,对非mMHCIC的进一步研究因差异差而受阻。通常,RP 制剂中的异质细胞类型不分青红皂白地装载 Ca2+敏感染料(例如 Fluo-4)。为了克服这些挑战并研究RP中的各种细胞类型,可以使用基因编码的Ca2+指标(GECIs)选择性地表达Ca2+敏感荧光在细胞类型的兴趣。
大多数研究阐明了PIC1s/ASMC中Ca2+瞬态特性,是通过成像平板RP组织制剂19、21、27实现的。由于 PIC1 是 PKJ 中唯一表达 smMHC 的细胞类型,因此 GECI、GCaMP 在 smMHC®细胞中的有条件表达适合在此配置中研究 PIC1。然而,由于PIC1和PIC2都表示PDGFR®,PDGFR®细胞中GCAMP变异的有条件表达禁止平板制剂中的细胞区分。为了规避这个问题,使用振动切除方法来区分PKJ组织壁24的PIC1和PIC2。为了揭示这些离散的细胞群,RP 被切开冠状,从而有可能根据已知的免疫造血标记和 GECI 表达模式识别肌肉壁中的 PIC2 和 PIC1。由于这种新的PKJ成像方法,PIC1和PIC2被发现显示独特的Ca2+信号属性24。此外,通过隔离PKJ地区最近的部分(图2),RP的心脏起搏器区域以以前没有完成的方式被保存下来。在这里,一个协议被描述,以显示如何使用颤音切除分离PKJ制剂从小鼠肾脏,如何设置这些准备Ca2+成像实验,以及如何区分不同的细胞类型跨越PKJ壁。
RP由不同RP区域观察到的具有不同细胞密度的细胞的异质群组成。PIC1(以前称为ASMC)在PKJ最为丰富,心脏起搏器活动起源于24。此处描述的协议允许调查人员将心脏起搏器区域与小鼠肾脏的其他部分隔离。通过使用颤音切割PKJ部分,RP的心脏起搏器区域(被确定为附着在帕伦奇马的肌肉带)保持完好无损,从而提供使用原位成像技术,在与细胞特异性荧光照点结合时准确研究RP心脏起搏器细胞。
虽然这种方法可以为RP的制路提供新的见解,但实验者应该熟悉一些考虑,以提高成像结果和分割效率。对于未经培训的用户来说,这种 PKJ 隔离和成像方法比典型的平板 RP 制剂的典型锐度解剖更容易学习。从整个肾脏中对RP进行尖锐解剖需要数周的一致实践,才能成功地分离出可行的组织进行生理实验。由于此颤音切除方案几乎不需要尖锐的解剖知识,因此没有解剖其他平滑肌肉结构经验的用户可以访问该方案。
但是,此协议需要注意一些关键点。成功地将肾脏粘附在振动体标本板上需要灵巧和耐心。如果肾脏方向不正确,并倾斜到一边,倾斜,而不是直部分将被削减。由于PKJ的微妙性质,斜角经常会破坏心脏起搏器区域的肌肉带。此外,倾斜部分的成像导致成像采集不良,因为细胞网络通常不在同一焦点平面上。这个过程也很费时,单个肾脏的分割通常需要长达一个小时来完成,在此期间,设置需要监测。
虽然振动器的运动可以加快,但如果速度增加太多(比协议中建议的>20%),刀片会碎裂,而不是干净地切开肾脏,导致细腻的PKJ结构的丧失。同样,切割速度过低会导致该节变得锯齿状。优化切割速度和刀片振幅至关重要。在处理振动器部分时也必须小心。由于其微妙的性质,PKJ肌肉很容易在处理过程中中断,并可能撕裂。训练有素的用户将能够收获大约1-2 PKJ区域每4个肾脏片,适合Ca2+ 成像实验。通常,不符合 Ca2+ 成像标准的 PKJ 部分具有:1) 不良的 GCaMP 表达,2) 扭曲的 PKJ 墙,或 3) 损坏的 PKJ 墙。对于数据分析,可以采样每个视场 (FOV) 大约 3-4 个细胞。
虽然 PDGFR®-GCAMP6f 和 SMC-GCAMP3 PKJ 部分的 FOV 中有许多细胞,但小组织运动通常将细胞排除在分析之外。这通常可以通过对图像应用稳定协议来解决。在制剂不移动的情况下,至少可以从PDGFR®-GCaMP6f部分取样3-5个细胞,从SMC-GCAMP3部分取样5-6个细胞。通常,从动物牺牲(小鼠的最佳年龄为 8-16 周)到进行 Ca2+ 成像实验所占用的时间为 2-3 小时,如果组织在需要时在冰冷溶液中孵育,则足以确保组织完整性。总之,这里描述了一个振动切除方案,从小鼠肾脏生成RP PKJ区域的完整制剂。该技术允许保留RP心脏起搏器区域,进行原位Ca2+ 成像研究,以研究RP起搏器机制。
The authors have nothing to disclose.
该项目由 NIDDK 的 R01 DK124509 资助。
24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |