Målet med denne protokol er at isolere intakt pacemaker regioner af musen nyre bækken ved hjælp af vibratome sektionsopderinger. Disse sektioner kan derefter bruges til in situ Ca2 + billeddannelse til at belyse Ca2 + forbigående egenskaber pacemaker celler og andre interstitielle celler i vibratome skiver.
Nyres bækkenet (RP) er en tragtformet, glat muskelstruktur, der letter normal urintransport fra nyrerne til urinrøret ved regelmæssige, fremdrivende sammentrækninger. Regelmæssige RP-sammentrækninger er afhængige af pacemakeraktivitet, som stammer fra den mest proksimale region af RP ved bækken-nyre krydset (PKJ). På grund af vanskelighederne med at få adgang til og bevare intakte præparater af PKJ, har de fleste undersøgelser af RP pacemaking fokuseret på enkeltcellet elektrofysiologi og Ca2 + billeddiagnostiske eksperimenter. Selv om vigtige afsløringer om RP pacemaking er opstået fra et sådant arbejde, disse eksperimenter har flere iboende begrænsninger, herunder manglende evne til præcist at bestemme cellulære identitet i blandede suspensioner og manglen på in situ billeddannelse af RP pacemaker aktivitet. Disse faktorer har resulteret i en begrænset forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for normale rytmiske RP sammentrækninger. I dette papir, er en protokol beskrevet til at forberede intakte segmenter af musen PKJ ved hjælp af en vibratome sektionsteknik. Ved at kombinere denne tilgang med mus, der udtrykker cellespecifikke reportere og genetisk kodede Ca2+-indikatorer, kan efterforskere være i stand til mere præcist at studere de specifikke celletyper og mekanismer, der er ansvarlige for peristaltiske RP-sammentrækninger, der er afgørende for normal urintransport.
Nyres bækkenet (RP) er en tragtformet, glat muskelstruktur, der transporterer urin fra nyrerne til urinrøret. RP transporterer urin ved at generere regelmæssige rytmiske sammentrækninger (peristalsis)1, 2,3,4,5, som driver en bolus af urin fra nyrerne distally til ureter og i sidste ende til blæren, hvor det opbevares, indtil micturition opstår6,7. Tab af denne regelmæssige aktivitet har alvorlige konsekvenser, herunder hydronephrose og nyresvigt1,3,8; Der er derfor et kritisk behov for at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for regelmæssige, rytmiske RP-sammentrækninger. Peristaltiske sammentrækninger stammer fra den mest proksimale region i RP-in bækken-nyre krydset (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 (Figur 1A–C) og formere sig distally at skubbe urin fra papilla i RP ( Figur1B). Elektrisk pacemaker aktivitet registreres i PKJ som spontane forbigående depolarizations10,11,12,13,15,16,17, som menes at opstå fra specialiserede pacemaker celler. Disse pacemaker celler, tidligere kaldet atypiske glatte muskelceller (ASMCs), menes at generere eller koordinere pacemaker aktivitet og drive sammentrækninger af “typiske” glatte muskelceller (SMCs)9,10,11,18,19,20,21,22,23.
ASMCs er mest rigelige i den proksimale RP, på PKJ (Figur 1A–C), hvor peristaltiske sammentrækninger og elektrisk pacemaker aktivitet stammer5,7, 8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. En nylig offentliggjort undersøgelse af denne gruppe identificeret blodplade-afledt vækstfaktor receptor-alpha (PDGFRα), i kombination med glat muskel myosin tung kæde (smMHC), som en unik biomarkør for disse interstitielle celler (ICs)24, en konstatering, der er blevet bekræftet af andre grupper25. Baseret på deres morfologi og proteinudtryksmønster blev disse celler kaldt PDGFRα+ IC type 1 (PIC1)24,26. PIC1s opholde sig i muskel lag af PKJ, hvor de viser højfrekvente, kort varighed Ca2 + transienter, menes at ligge til grund for generering af pacemaker potentialer24. Der findes dog andre celletyper i PKJ, herunder ikke-smMHC-udtryk PDGFRα+ ICs (PIC2s) i adventitiallaget. Tidligere rapporter har antydet , at ikke-smMHC ICs kan deltage i reguleringen af pacemaker aktivitet19. Yderligere undersøgelse af ikke-smMHC-ICs hæmmes imidlertid af dårlig skelnen under Ca 2+-billeddiagnostiske undersøgelser. Typisk er heterogene celletyper i RP-præparaterne vilkårligt fyldt med Ca2+følsomme farvestoffer (f.eks. Fluo-4). For at overvinde disse udfordringer og studere en række celletyper i RP kan genetisk kodede Ca2+-indikatorer (GECIs) anvendes til selektivt at udtrykke Ca2+følsomme fluorophorer i celletyper af interesse.
De fleste undersøgelser , der belyser Ca2+ forbigående egenskaber i PIC1s/ASMCs , blev opnået ved at billeddannelse af RP-vævspræparater med fladt blad19,21,27. Da PIC1’er er den eneste celletype i PKJ, der udtrykker smMHC, er betinget udtryk for GECI, GCaMP, i smMHC+ celler egnet til at studere PIC1’er i denne konfiguration. Men da PIC1s og PIC2s begge udtrykker PDGFRα, forbyder betinget udtryk for GCaMP-varianter i PDGFRα+ celler celleforskel i flade arkpræparater. For at omgå dette problem blev der anvendt en vibratomesektionsmetode til at skelne mellem PIC1’er og PIC2’er på tværs af PKJ-vævsvæggen24. For at afsløre disse diskrete cellulære populationer blev RP sektionsbestemt koronar, hvilket gjorde det muligt at identificere PIC2’er i adventitia og PIC1’er i muskelvæggen baseret på kendt immunohistokemisk mærkning og GECI-udtryksmønstre. Som et resultat af denne nye PKJ billedbehandling tilgang, PIC1s og PIC2s blev anset for at vise forskellige Ca2 + signalering egenskaber24. Ved at isolere de mest proksimale dele af PKJ-regionen (figur 2) blev RP’s pacemakerregion desuden bevaret på en måde, der ikke tidligere var blevet gennemført. Her er en protokol beskrevet for at vise, hvordan man isolerer PKJ-præparater fra muse nyrerne ved hjælp af vibratomsektionering, hvordan man opsætter disse præparater til Ca2+ billedeksperimenter, og hvordan man skelner mellem de forskellige celletyper på tværs af PKJ-væggen.
RP består af en heterogen population af celler med differentialcelletæthed observeret i forskellige RP-regioner. PIC1s (tidligere benævnt ASMCs) er mest rigelige i PKJ, hvor pacemaker aktivitet stammerfra 24. Protokollen, der er beskrevet her, giver efterforskerne mulighed for at isolere pacemakerområdet fra resten af muse nyrerne. Ved at skære dele af PKJ ved hjælp af en vibratome, pacemaker regioner RP (identificeret som muskelbånd knyttet til parenchyma) holdes intakt, hvilket giver mulighed for brug af in situ billeddannelse til præcist at studere RP pacemaker celler, når det kombineres med celle-specifikke fluorescens reportere.
Mens denne tilgang kan give ny indsigt i RP pacemaking, der er nogle overvejelser, at eksperimenterende bør være bekendt med at forbedre billedbehandling resultater og sektionsopdelning effektivitet. For en utrænet bruger er denne metode til PKJ isolation og billeddannelse lettere at lære end typisk skarp dissektion af fladarks RP-præparater. Skarp dissektion af RP fra hele nyrer kræver ugers konsekvent praksis for med succes at isolere levedygtige væv til fysiologiforsøg. Da denne vibratome sektionsprotokol kræver lidt skarp dissektion viden, det er tilgængeligt for brugere, der ikke har erfaring dissekere andre glatte muskelstrukturer.
Der er dog nogle kritiske punkter at bemærke for denne protokol. Succesfuldt at klæbe nyrer til vibratome prøvepladen kræver fingerfærdighed og tålmodighed. Hvis nyrerne er orienteret forkert og læner sig til den ene side, skrå snarere end lige sektioner vil blive skåret. På grund af PKJ’s sarte natur kan den skrå vinkel ofte ødelægge pacemakerområdets muskelbånd. Desuden resulterer billeddannelse af skrå sektioner i dårlig billeddannelse erhvervelse som cellenetværk er ikke typisk i samme brændplan. Proceduren er også tidskrævende, med sektionsopderinger af en enkelt nyre, der ofte tager op til en time at gennemføre, i hvilket tidsrum opsætningen kræver overvågning.
Mens vibratomets bevægelse kan fremskyndes, vil bladet, hvis hastigheden øges for meget (>20% end det, der anbefales i protokollen), makulere i stedet for rent at skære nyrerne, hvilket resulterer i tab af sarte PKJ-strukturer. På samme måde kan en skærehastighed, der er for lav, få sektionen til at blive takkede. Optimering af skærehastighed og vingeforstærkning er afgørende. Der skal også udvises forsigtighed ved håndtering af vibratomesektioner. På grund af deres sarte natur forstyrres PKJ-musklerne let under håndtering og kan rive. En veluddannet bruger vil være i stand til at høste ca 1-2 PKJ regioner pr 4 nyre skiver, der er egnet til Ca2 + billeddiagnostiske eksperimenter. Typisk, PKJ sektioner, der ikke opfylder Ca2 + billeddannelse kriterier har: 1) dårlig GCaMP udtryk, 2) en forvrænget PKJ væg, eller 3) en brækket PKJ væg. Til dataanalyse kunne der udtages prøver af ca. 3-4 celler pr. synsfelt (FOV).
Mens der er mange celler i FOV af PDGFRα-GCaMP6f og SMC-GCaMP3 PKJ sektioner, små vævsbevægelser ofte udelukke celler fra analyse. Dette kan normalt løses ved at anvende en stabiliseringsprotokol på billeder. Under forhold, hvor præparater ikke bevæger sig, kan der udtages prøver af mindst 3-5 celler fra PDGFRα-GCaMP6f-sektioner og 5-6 celler fra SMC-GCaMP3-sektioner. Typisk er den tid, det tager fra dyreofring (optimal alder for mus er 8-16 uger) til at udføre Ca2 + billeddiagnostiske eksperimenter 2-3 timer, hvilket er tilstrækkeligt til at sikre vævsintegritet, hvis væv inkuberes i iskolde opløsninger under hele proceduren, når det kræves. Sammenfattende er en vibratomeskæringsprotokol blevet beskrevet her for at generere intakte præparater af RP PKJ-regioner fra muse nyrerne. Denne teknik gør det muligt at bevare RP pacemaker regioner for in situ Ca2 + billeddiagnostik undersøgelser for at undersøge RP pacemaker mekanismer.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af R01 DK124509 fra NIDDK.
24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |