Målet med denne protokollen er å isolere intakte pacemaker regioner av musen nyre bekken ved hjelp av vibratome seksjonering. Disse seksjonene kan deretter brukes til in situ Ca2+ avbildning for å belyse Ca2+ forbigående egenskaper til pacemakerceller og andre interstitielle celler i vibratomskiver.
Nyrebekkenet (RP) er en traktformet, glatt muskelstruktur som letter normal urintransport fra nyrene til urinlederen ved regelmessige, fremdriftssammentrekninger. Regelmessige RP-sammentrekninger er avhengige av pacemakeraktivitet, som stammer fra den mest proksimale regionen av RP ved bekken-nyrekrysset (PKJ). På grunn av vanskeligheten med å få tilgang til og bevare intakte preparater av PKJ, har de fleste undersøkelser om RP-pacemaking fokusert på encellet elektrofysiologi og Ca2 + bildebehandlingseksperimenter. Selv om viktige avsløringer om RP-pacemaking har kommet ut av slikt arbeid, har disse eksperimentene flere iboende begrensninger, inkludert manglende evne til å nøyaktig bestemme cellulær identitet i blandede suspensjoner og mangelen på in situ-avbildning av RP pacemakeraktivitet. Disse faktorene har resultert i en begrenset forståelse av mekanismene som ligger til grunn for normale rytmiske RP-sammentrekninger. I dette dokumentet beskrives en protokoll for å forberede intakte segmenter av mus PKJ ved hjelp av en vibratome seksjoneringsteknikk. Ved å kombinere denne tilnærmingen med mus som uttrykker cellespesifikke reportere og genetisk kodede Ca2+ indikatorer, kan undersøkere kunne studere de spesifikke celletypene og mekanismene som er ansvarlige for peristaltiske RP-sammentrekninger som er avgjørende for normal urintransport, mer nøyaktig.
Nyrebekkenet (RP) er en traktformet, glatt muskelstruktur som transporterer urin fra nyrene til urinlederen. RP transporterer urin ved å generere regelmessige rytmiske sammentrekninger (peristaltikk)1,2,3,4,5, som driver en bolus av urin fra nyrene distalt til urinlederen og til slutt til blæren, hvor den lagres til micturition oppstår6,7. Tap av denne vanlige aktiviteten har alvorlige konsekvenser, inkludert hydronefrose og nyresvikt1,3,8; Derfor er det et kritisk behov for å studere mekanismene som ligger til grunn for regelmessige, rytmiske RP-sammentrekninger. Peristaltiske sammentrekninger stammer fra den mest proksimale regionen i RP-i bekken-nyrekrysset (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 ( Figur1A–C) og forplante seg distisk for å skyve urin fra papillaen inn i RP ( Figur1B). Elektrisk pacemakeraktivitet registreres i PKJ som spontane forbigående depolariseringer10,11,12,13,15,16,17, som antas å oppstå fra spesialiserte pacemakerceller. Disse pacemakercellene, tidligere kalt atypiske glatte muskelceller (ASMCer), antas å generere eller koordinere pacemakeraktivitet og drive sammentrekningene av “typiske” glatte muskelceller (SMB-er) 9,10,11,18,19,20,21,22,23.
ASMCer er mest tallrike i den proksimale RP, ved PKJ (Figur 1A–C), der peristaltiske sammentrekninger og elektrisk pacemakeraktivitet stammer fra5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. En nylig publisert studie av denne gruppen identifiserte blodplate-avledet vekstfaktor reseptor-alfa (PDGFRα), i kombinasjon med glatt muskel myosin tung kjede (smMHC), som en unik biomarkør for disse interstitiale cellene (ICs)24, et funn som har blitt bekreftet av andre grupper25. Basert på deres morfologi og proteinuttrykksmønster ble disse cellene kalt PDGFRα+ IC type 1 (PIC1)24,26. PIC1s ligger i muskellaget til PKJ der de viser høyfrekvente, kortvarige Ca2+ transienter, antatt å ligge til grunn for genereringen av pacemakerpotensialer24. Det finnes imidlertid andre celletyper i PKJ, inkludert PDGFRα+ ICer (PIC2s) som ikke er smMHC-uttrykkende, i det eventyrlige laget. Tidligere rapporter har antydet at ikke-smMHC ICer kan delta i reguleringen av pacemaker aktivitet19. Videre studier av ikke-smMHC ICs hindres imidlertid av dårlig distinksjon under Ca2 + bildestudier. Vanligvis er heterogene celletyper i RP-preparatene ukritisk lastet med Ca2+-sensitive fargestoffer (f.eks. For å overvinne disse utfordringene og for å studere en rekke celletyper i RP, kan genetisk kodede Ca2+ indikatorer (GECIer) brukes til selektivt å uttrykke Ca2+-sensitive fluoroforer i celletyper av interesse.
De fleste studiene som belyste Ca2 + forbigående egenskaper i PIC1s / ASMCs ble oppnådd ved å avbilde flat-sheet RP vev preparater19,21,27. Siden PIC1s er den eneste celletypen i PKJ som uttrykker smMHC, er betinget uttrykk for GECI, GCaMP, i smMHC+ celler hensiktsmessig å studere PIC1s i denne konfigurasjonen. Men ettersom PIC1s og PIC2s begge uttrykker PDGFRα, forbyr betinget uttrykk for GCaMP-varianter i PDGFRα+ celler celleforskjell i flatarkforberedelser. For å omgå dette problemet ble en vibratome seksjonering tilnærming brukt til å skille PIC1s og PIC2s over PKJ vev veggen24. For å avsløre disse diskrete cellulære populasjonene ble RP seksjonert koronally, noe som gjorde det mulig å identifisere PIC2s i adventitia og PIC1s i muskelveggen basert på kjent immunhiistokjemisk merking og GECI-uttrykksmønstre. Som et resultat av denne nye PKJ-bildemetoden ble PIC1s og PIC2s funnet å vise distinkte Ca2 + signalegenskaper24. Videre, ved å isolere de mest proksimale delene av PKJ-regionen (figur 2), ble pacemakerområdet til RP bevart på en måte som ikke var oppnådd tidligere. Her beskrives en protokoll for å vise hvordan du isolerer PKJ-preparater fra musen nyre ved hjelp av vibratome seksjonering, hvordan du setter opp disse forberedelsene for Ca2 + bildebehandling eksperimenter, og hvordan du skiller de forskjellige celletypene over PKJ-veggen.
RP består av en heterogen populasjon av celler med differensialcelletetthet observert i ulike RP-regioner. PIC1s (tidligere referert til som ASMCs) er mest tallrike i PKJ, hvor pacemakeraktivitet stammer fra24. Protokollen, beskrevet her, tillater etterforskere å isolere pacemaker-regionen fra resten av musen nyre. Ved å kutte deler av PKJ ved hjelp av en vibratom, holdes pacemakerregionene i RP (identifisert som muskelbånd festet til parenchyma) intakt, og gir dermed bruk av in situ-avbildning for å nøyaktig studere RP pacemakerceller når de kombineres med cellespesifikke fluorescensreportere.
Selv om denne tilnærmingen kan gi ny innsikt i RP-tempomaking, er det noen hensyn som eksperimenter bør være kjent med for å forbedre bilderesultatene og seksjoneringseffektiviteten. For en utrent bruker er denne metoden for PKJ-isolasjon og avbildning lettere å lære enn typisk skarp disseksjon av flatark RP-preparater. Skarp disseksjon av RP fra hele nyrer krever uker med konsistent praksis for å isolere levedyktig vev for fysiologiske eksperimenter. Siden denne vibratome seksjoneringsprotokollen krever lite skarp disseksjonskunnskap, er den tilgjengelig for brukere som ikke har erfaring med å dissekere andre glatte muskelstrukturer.
Det er imidlertid noen kritiske punkter å merke seg for denne protokollen. Vellykket å følge nyrer til vibratomprøveplaten krever fingerferdighet og tålmodighet. Hvis nyrene er orientert feil og lener seg til den ene siden, vil skrå i stedet for rette seksjoner bli kuttet. På grunn av PKJ-ens delikate natur kan den skrå vinkelen ofte ødelegge muskelbåndene i pacemaker-regionen. Videre resulterer avbildning av skrå seksjoner i dårlig bildeinnsamling, da cellenettverk vanligvis ikke er i samme fokusplan. Prosedyren er også tidkrevende, med seksjonering av en enkelt nyre som ofte tar opptil en time å fullføre, i løpet av hvilken tid oppsettet krever overvåking.
Mens bevegelsen av vibratomet kan sped opp, hvis hastigheten økes for mye (>20% enn det som anbefales i protokollen), vil bladet makulere i stedet for å kutte nyrene rent, noe som resulterer i tap av delikate PKJ-strukturer. På samme måte kan en skjærehastighet som er for lav føre til at delen blir hakket. Optimalisering av skjærehastighet og bladamplitude er viktig. Det må også utvises forsiktighet ved håndtering av vibratome seksjoner. På grunn av sin delikate natur blir PKJ-musklene lett forstyrret under håndtering og kan rive. En godt trent bruker vil kunne høste ca 1-2 PKJ-regioner per 4 nyreskiver som passer for Ca2 + bildebehandlingsforsøk. Vanligvis har PKJ-seksjoner som ikke oppfyller Ca2+ avbildningskriterier: 1) dårlig GCaMP-uttrykk, 2) en kontret PKJ-vegg eller 3) en ødelagt PKJ-vegg. For dataanalyse kan omtrent 3-4 celler per synsfelt (FOV) ta prøver.
Mens det er mange celler i FOV av PDGFRα-GCaMP6f og SMC-GCaMP3 PKJ seksjoner, utelukker små vevsbevegelser ofte celler fra analyse. Dette kan vanligvis løses ved å bruke en stabiliseringsprotokoll på bilder. Under forhold der preparater ikke beveger seg, kan minst 3-5 celler prøves fra PDGFRα-GCaMP6f-seksjoner og 5-6 celler fra SMC-GCaMP3-seksjoner. Vanligvis er tiden tatt fra dyreoffer (optimal alder for mus 8-16 uker) til å utføre Ca2 + bildebehandlingsforsøk er 2-3 timer, noe som er tilstrekkelig for å sikre vevsintegritet, hvis vev inkuberes i iskalde løsninger gjennom hele prosedyren når det er nødvendig. Oppsummert har en vibratom skjæreprotokoll blitt beskrevet her for å generere intakte preparater av RP PKJ-regioner fra musen nyre. Denne teknikken gjør det mulig å bevare RP pacemaker regioner for in situ Ca2 + bildestudier for å undersøke RP pacemaker mekanismer.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble finansiert av R01 DK124509 fra NIDDK.
24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |