JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) образцов биологических тканей

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

Этот протокол описывает рутинный метод использования последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM), мощного метода 3D-визуализации. Успешное применение SBF-SEM зависит от правильной фиксации и окрашивания тканей, а также тщательного рассмотрения настроек визуализации. Этот протокол содержит практические соображения для всего этого процесса.

Abstract

Последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) позволяет коллекционировать от сотен до тысяч серийно зарегистрированных ультраструктурных изображений, предлагая беспрецедентный трехмерный вид микроанатомии тканей. В то время как sBF-SEM в последние годы наблюдается экспоненциальный рост использования, технические аспекты, такие как надлежащая подготовка тканей и параметры визуализации, имеют первостепенное значение для успеха этого метода визуализации. Эта система визуализации выигрывает от автоматизированного характера устройства, позволяя оставлять микроскоп без присмотра во время процесса визуализации, с автоматизированным сбором сотен изображений, возможных за один день. Однако без соответствующей тканевой подготовки клеточная ультраструктура может быть изменена таким образом, что могут быть сделаны неправильные или вводящие в заблуждение выводы. Кроме того, изображения генерируются путем сканирования лицевой стороны блока биологического образца, встроенного в смолу, и это часто создает проблемы и соображения, которые необходимо решить. Накопление электронов внутри блока во время визуализации, известное как «заряд ткани», может привести к потере контраста и неспособности оценить клеточную структуру. Более того, в то время как увеличение интенсивности / напряжения электронного пучка или снижение скорости сканирования пучка может увеличить разрешение изображения, это также может иметь неприятный побочный эффект повреждения смоляного блока и искажения последующих изображений в серии изображений. Здесь мы представляем рутинный протокол подготовки образцов биологических тканей, который сохраняет клеточную ультраструктуру и уменьшает заряд тканей. Мы также предоставляем визуальные соображения для быстрого получения высококачественных серийных изображений с минимальным повреждением тканевого блока.

Introduction

Последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) была впервые описана Лейтоном в 1981 году, где он создал сканирующий электронный микроскоп, дополненный встроенным микротомом, который мог разрезать и визуализировать тонкие участки ткани, встроенные в смолу. К сожалению, технические ограничения ограничили его использование проводящими образцами, поскольку непроводящие образцы, такие как биологическая ткань, накапливали неприемлемые уровни зарядки (накопление электронов в образцеткани) 1. В то время как покрытие грани блока между разрезами испаривающимся углеродным снижением тканевой зарядки, это значительно увеличило время получения изображений и хранения изображений оставалось проблемой, поскольку компьютерные технологии в то время были недостаточны для управления большими размерами файлов, созданных устройством. Эта методология была пересмотрена Denk и Horstmann в 2004 году с использованием SBF-SEM, оснащенного камерой переменного давления2. Это позволило ввести водяной пар в камеру визуализации, что уменьшает заряд внутри образца, делая визуализацию непроводниковых образцов жизнеспособной, хотя и с потерей разрешения изображения. Дальнейшие усовершенствования в методах подготовки тканей и визуализации теперь позволяют проводить визуализацию с использованием высокого вакуума, а визуализация SBF-SEM больше не полагается на водяной пар для рассеивания заряда3,4,5,6,7,8,9. В то время как sBF-SEM в последние годы наблюдается экспоненциальный рост использования, технические аспекты, такие как надлежащая подготовка тканей и параметры визуализации, имеют первостепенное значение для успеха этого метода визуализации.

SBF-SEM позволяет автоматически получать тысячи серийно зарегистрированных изображений электронной микроскопии с планарным разрешением до 3-5 нм10,11. Ткань, пропитанная тяжелыми металлами и встроенная в смолу, помещается в сканирующий электронный микроскоп (SEM), содержащий ультрамикротом, оснащенный алмазным ножом. Алмазным ножом ограняется плоская поверхность, нож убирается, а поверхность блока сканируется в растровом рисунке электронным пучком для создания изображения ультраструктуры ткани. Затем блок поднимается на определенное количество (например, 100 нм) по оси z, известное как «z-шаг», и новая поверхность разрезается перед повторением процесса. Таким образом, создается 3-мерный (3D) блок изображений по мере разрезания ткани. Эта система визуализации также выигрывает от автоматизированного характера устройства, позволяя оставлять микроскоп без присмотра во время процесса визуализации, с автоматизированным сбором сотен изображений, возможных за один день.

В то время как визуализация SBF-SEM в основном использует обратно рассеянные электроны для формирования изображения лица блока, вторичные электроны генерируются во время процесса визуализации12. Вторичные электроны могут накапливаться вместе с обратно рассеянными и первичными пучковыми электронами, которые не покидают блок, и производить «заряд ткани», что может привести к локализованному электростатическому полю на грани блока. Это накопление электронов может исказить изображение или привести к выбросу электронов из блока и способствовать сигналу, собранного детектором обратного рассеяния, уменьшая отношение сигнал/шум13. В то время как уровень заряда тканей может быть уменьшен за счет снижения напряжения или интенсивности электронного пучка или уменьшения времени пребывания пучка, это приводит к уменьшению отношения сигнал/шум14. Когда используется электронный пучок более низкого напряжения или интенсивности, или пучку разрешено обитать только в пределах каждого пиксельного пространства в течение более короткого периода времени, меньше обратно рассеянных электронов выбрасывается из ткани и захватывается электронным детектором, что приводит к более слабому сигналу. Денк и Хорстманн решли эту проблему, вводя водяной пар в камеру, тем самым уменьшая заряд в камере и на лицевой стороне блока за счет разрешения изображения. При давлении в камере 10-100 Па часть электронного пучка рассеивается, способствуя шуму изображения и потере разрешения, однако это также производит ионы в камере образца, которые нейтрализуют заряд в блоке образца2. Более поздние методы нейтрализации заряда внутри блока образца используют фокальный газовый впрыск азота по лицевой стороне блока во время визуализации или введение отрицательного напряжения на ступень SBF-SEM для уменьшения энергии зонда-пучка-зацепки и увеличения собранного сигналана 6,7,15. Вместо того, чтобы вводить смещение ступени, давление в камеру или локализованную инъекцию азота для уменьшения накопления заряда на поверхности блока, также можно увеличить проводимость смолы путем введения углерода в смесь смолы, что позволяет более агрессивные настройки изображения16. Следующий общий протокол является адаптацией протокола Deerinck et al., опубликованного в 2010 году, и охватывает модификации методологий подготовки тканей и визуализации, которые мы сочли полезными для минимизации заряда тканей при сохранении получения изображений с высоким разрешением3,17,18,19. В то время как ранее упомянутый протокол сосредоточен на обработке тканей и пропитке тяжелыми металлами, этот протокол дает представление о визуализации, анализе данных и рабочем процессе реконструкции, присущем исследованиям SBF-SEM. В нашей лаборатории этот протокол был успешно и воспроизводимо применен к широкому кругу тканей, включая структуры роговицы и переднего сегмента, веко, слезную и более твердую железу, сетчатку и зрительный нерв, сердце, легкие и дыхательные пути, почки, печень, мышцы кремастера и кору головного мозга / продолговатый мозг, а также у различных видов, включая мышь, крысу, кролика, морскую свинку, рыбу, монослойные и стратифицированные клеточные культуры, свиней, нечеловеческих приматов, а также человека20,21,22,23. Хотя небольшие изменения могут быть полезны для конкретных тканей и приложений, этот общий протокол оказался очень воспроизводимым и полезным в контексте нашего основного средства визуализации.

Protocol

Все животные обрабатывались в соответствии с руководящими принципами, описанными в Заявлении Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в исследованиях зрения и офтальмологических исследованиях и Руководящих принципах обращения с животным?…

Representative Results

Роговица мышиЭтот протокол широко применялся к роговице мыши. Было показано, что с помощью визуализации SBF-SEM сеть пучков микрофибрила без эластина (EFMB) присутствует в роговице взрослой мыши. Ранее считалось, что эта сеть присутствовала только во время эмбрионального и ранне?…

Discussion

Целью данной работы по методам является освещение методологии подготовки и визуализации тканей, которая позволила нашей лаборатории надежно захватывать изображения серийной электронной микроскопии высокого разрешения, и указать на критические шаги, которые приводят к этому результ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сэма Хэнлона, Эвелин Браун и Маргарет Гондо за их прекрасную техническую помощь. Это исследование было частично поддержано Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01 EY-018239 и P30 EY007551 (Национальный институт глаз), частично Фондом льва для зрения, а частично NIH 1R15 HD084262-01 (Национальный институт детского здоровья и развития человека).

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, &. #. 3. 5. 2. ;., Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we–where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. 2nd edn. , (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. . Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , (1988).
  69. Mouton, P. R. . Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , (2002).

Tags

Keywords: Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM)Heavy Metal StainingResin InfiltrationAutomated Image Capture
check_url/62045?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image