Seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiska vävnadsprover

Summary

Detta protokoll beskriver en rutinmetod för att använda seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM), en kraftfull 3D-bildteknik. Framgångsrik tillämpning av SBF-SEM beror på korrekt fixering och vävnad färgning tekniker, samt noggrant övervägande av bildinställningar. Detta protokoll innehåller praktiska överväganden för hela denna process.

Abstract

Seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) möjliggör insamling av hundratals till tusentals serieregistrerade strukturella bilder, vilket ger en oöverträffad tredimensionell vy av vävnad mikroanatomi. Medan SBF-SEM har sett en exponentiell ökning av användningen under de senaste åren, tekniska aspekter såsom korrekt vävnad beredning och bildframställning parametrar är av största vikt för framgången med denna bildframställning modalitet. Detta bildsystem drar nytta av enhetens automatiserade karaktär, vilket gör att man kan lämna mikroskopet obevakat under bildprocessen, med den automatiska samlingen av hundratals bilder möjliga på en enda dag. Men utan lämplig vävnad förberedelse cellulära ultrastruktur kan ändras på ett sådant sätt att felaktiga eller vilseledande slutsatser kan dras. Dessutom genereras bilder genom att skanna block-ansiktet på ett hartsinbäddat biologiskt prov och detta innebär ofta utmaningar och överväganden som måste åtgärdas. Ackumulering av elektroner inom blocket under avbildning, känd som “vävnadsladdning”, kan leda till en förlust av kontrast och en oförmåga att uppskatta cellulär struktur. Dessutom, medan ökande elektronstråleintensitet / spänning eller minskande strålskanningshastighet kan öka bildupplösningen, kan detta också ha den olyckliga bieffekten att skada hartsblocket och förvränga efterföljande bilder i bildserien. Här presenterar vi ett rutinprotokoll för beredning av biologiska vävnadsprover som bevarar cellulär ultrastruktur och minskar vävnadsladdningen. Vi tillhandahåller också bildframställning överväganden för snabb förvärv av högkvalitativa seriella bilder med minimal skada på vävnad block.

Introduction

Seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) beskrevs först av Leighton 1981 där han skapade ett scanningelektronmikroskop förstärkt med en inbyggd mikrotom som kunde skära och avbilda tunna delar av vävnad inbäddad i harts. Tyvärr begränsade tekniska begränsningar användningen till ledande prover, eftersom icke-ledande prover som biologisk vävnad ackumulerade oacceptabla laddningsnivåer (elektronuppbyggnad i vävnadsprovet)¹. Medan beläggning block-face mellan nedskärningar med avdunstad kol minskad vävnad laddning, denna kraftigt ökade bildförvärvstid och bildlagring förblev ett problem eftersom datorteknik vid den tiden var otillräcklig för att hantera de stora filstorlekar som skapats av enheten. Denna metod sågs över av Denk och Horstmann 2004 med hjälp av en SBF-SEM utrustad med en variabel tryckkammare^2. Detta gjorde det möjligt att föra in vattenånga i bildkammaren, vilket minskar laddningen i provet, vilket gör avbildning av icke-ledande prover livskraftiga, om än med förlust av bildupplösning. Ytterligare förbättringar av vävnadsberednings- och bildframställningsmetoder möjliggör nu avbildning med högt vakuum, och SBF-SEM-avbildning förlitar sig inte längre på vattenånga för att avleda^{laddning 3,4,5,6,7,8,9}. Medan SBF-SEM har sett en exponentiell ökning av användningen under de senaste åren, tekniska aspekter såsom korrekt vävnad beredning och bildframställning parametrar är av största vikt för framgången med denna bildframställning modalitet.

SBF-SEM möjliggör automatiserad insamling av tusentals serieregistrerade elektronmikroskopibilder, med planupplösning så liten som 3-5 nm^10,11. Vävnad, impregnerad med tungmetaller och inbäddad i harts, placeras i ett scanningelektronmikroskop (SEM) som innehåller en ultramicrotome utrustad med en diamantkniv. En plan yta skärs med diamantkniven, kniven dras tillbaka och blockets yta skannas i ett rastermönster med en elektronstråle för att skapa en bild av vävnads ultrastruktur. Blocket höjs sedan en angiven mängd (t.ex. 100 nm) i z-axeln, känd som ett “z-steg”, och en ny yta skärs innan processen upprepas. På detta sätt produceras ett 3-dimensionellt (3D) block av bilder när vävnaden skärs bort. Detta bildsystem drar ytterligare nytta av enhetens automatiserade karaktär, vilket gör att man kan lämna mikroskopet obevakat under bildprocessen, med den automatiserade samlingen av hundratals bilder möjliga på en enda dag.

Medan SBF-SEM-avbildning främst använder bakåtstänkta elektroner för att bilda en bild av block-face, genereras sekundära elektroner under bildprocessen¹². Sekundära elektroner kan ackumuleras, tillsammans med backscattered och primärstråleelektroner som inte flyr blocket, och producera “vävnadsladdning”, vilket kan leda till ett lokaliserat elektrostatiskt fält vid block-face. Denna elektronackumulering kan förvränga bilden eller orsaka att elektroner matas ut från blocket och bidrar till signalen som samlas in av backscatterdetektorn, vilket minskar signal-till-brusförhållandet¹³. Medan nivån på vävnadsladdningen kan minskas genom att elektronstrålens spänning eller intensitet minskas, eller minska strålens uppehållstid, resulterar detta i ett minskat signal-till-brusförhållande¹⁴. När en elektronstråle med lägre spänning eller intensitet används, eller om strålen endast får bo inom varje pixelutrymme under en kortare tid, matas mindre bakåtstänkta elektroner ut från vävnaden och fångas upp av elektrondetektorn vilket resulterar i en svagare signal. Denk och Horstmann hanterade detta problem genom att införa vattenånga i kammaren och därigenom minska laddningen i kammaren och på blockytan på bekostnad av bildupplösningen. Med ett kammartryck på 10-100 Pa är en del av elektronstrålen utspridd vilket bidrar till bildljud och förlust av upplösning, men detta producerar också joner i provkammaren som neutraliserar laddningen inom^{provblocket 2}. Nyare metoder för neutralisering av laddning inom provblocket använder fokal gasinsprutning av kväve över block-ytan under avbildning, eller införande av negativ spänning till SBF-SEM-stadiet för att minska sondstråle-slevande energi och öka signalen^{som samlas in 6,7,15}. I stället för att införa scenförskjutning, kammartryck eller lokaliserad kväveinjektion för att minska laddningsuppbyggnaden på blockytan, är det också möjligt att öka hartsens ledningsförmåga genom att införa kol i hartsblandningen vilket möjliggör mer aggressiva avbildningsinställningar¹⁶. Följande allmänna protokoll är en anpassning av Deerinck et al. protokollet som publicerades 2010 och täcker ändringar av vävnadsberednings- och bildmetoder som vi fann användbara för att minimera vävnadsladdning samtidigt som högupplöst bildförvärv^3,17,18,19. Medan det tidigare nämnda protokollet fokuserade på vävnadsbearbetning och tungmetallimpregnering, ger detta protokoll insikt i arbetsflödet för avbildning, dataanalys och rekonstruktion som är inneboende i SBF-SEM-studier. I vårt laboratorium har detta protokoll framgångsrikt och reproducerbart tillämpats på en mängd olika vävnader inklusive hornhinna och främre segmentstrukturer, ögonlock, lacrimal och harderian körtel, näthinnan och optik nerv, hjärta, lunga och luftvägar, njure, lever, cremaster muskel, och hjärnbarken / medulla, och i en mängd olika arter inklusive mus, råtta, kanin, marsvin, fisk, monolayer och stratifierade cellkulturer, gris, icke-mänskliga primater, liksom mänskliga^20,21,22,23. Även om små förändringar kan vara värda för specifika vävnader och applikationer, har detta allmänna protokoll visat sig vara mycket reproducerbart och användbart i samband med vår kärnavbildningsanläggning.

Protocol

Alla djur hanterades enligt de riktlinjer som beskrivs i Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research och University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alla djurförsök godkändes av de institutioner där de hanterades: Mus, råtta, kanin, marsvin och icke-mänskliga primatprocedurer godkändes av University of Houston Animal Care and Use Committee, zebrafiskprocedurer godkändes av DePauw University Animal Care and Use C…

Representative Results

Mus HornhinnaDetta protokoll har tillämpats i stor utsträckning på mus hornhinnan. Med hjälp av SBF-SEM imaging visade sig ett nätverk av elastin-fria mikrofibril buntar (EFMBs) vara närvarande inom den vuxna mus hornhinnan. Man trodde tidigare att detta nätverk endast var närvarande under embryonal och tidig postnatal utveckling. SBF-SEM visade ett omfattande EFMB-nätverk i hela hornhinnan, med enskilda fibrer som visade sig vara 100-200 nm i diameter när de mättes i tvärsnitt. Det konst…

Discussion

Syftet med detta metodpapper är att belysa vävnadsberednings- och bildbehandlingsmetoden som har gjort det möjligt för vårt labb att på ett tillförlitligt sätt fånga högupplösta seriella elektronmikroskopibilder och att peka på kritiska steg som leder till detta resultat samt potentiella fallgropar som kan uppstå vid utförandet av SBF-SEM-avbildning. Framgång med detta protokoll kräver korrekt fixering av vävnad, impregnering av tungmetaller i provet, modifieringar av inbäddningshartset för att minska …

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.