Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioallantóica intravital rápida e quantitativa
Summary
Este é um método eficaz para testar supressores ou condutores de metástase de câncer. As células, transduzidas com uma biblioteca de expressão, são injetadas na vasculatura da membrana corioallantóica do frango para formar colônias metastáticas. Colônias que têm diminuído ou aumentado a invasividade são extirpadas, expandidas, reinjetadas para confirmar seu fenótipo e, finalmente, analisadas usando alto sequenciamento de rendimento.
Abstract
Os recentes avanços na pesquisa sobre câncer ilustraram a natureza altamente complexa da metástase do câncer. Vários genes ou redes de genes estão envolvidos na regulação diferencial de genes em cascata metastáticas do câncer e produtos genéticos dependentes do tipo de câncer, tecido e características individuais do paciente. Estes representam alvos potencialmente importantes para terapêutica genética e abordagens medicinais personalizadas. O desenvolvimento de plataformas de triagem rápida é essencial para a identificação desses alvos genéticos.
A membrana corioallantóica do filhote (CAM) é uma membrana altamente vascularizada, rica em colágeno localizada sob a casca de ovo que permite a troca de gás no embrião em desenvolvimento. Devido à localização e vascularização da CAM, desenvolvemos-a como um modelo de metástase intravital de câncer humano que permite a xenoenxerização robusta de células cancerígenas humanas e a imagem em tempo real das interações celulares cancerígenas com a matriz rica em colágeno e a vasculatura.
Utilizando este modelo, uma plataforma de triagem quantitativa foi projetada para a identificação de novos condutores ou supressores de metástase de câncer. Transturamos um grupo de células cancerígenas HEp3 com uma biblioteca completa de genes de genoma humano, depois injetamos as células, em baixa densidade, na vasculatura cam. As células proliferaram e formaram colônias de células de tumor único. Colônias individuais que não puderam invadir o tecido CAM eram visíveis como um fenótipo de colônia compacta e excisadas para identificação do shRNA transduzido presente nas células. Imagens de colônias individuais foram avaliadas por sua invasividade. Foram realizadas várias rodadas de seleções para diminuir a taxa de falsos positivos. Clones individuais e isolados de células cancerígenas ou clones recém-projetados que expressam genes de interesse foram submetidos a ensaios de formação de tumores primários ou análise de co-opção de vasculatura de células cancerosas. Em resumo, apresentamos uma plataforma de triagem rápida que permite a identificação de alvos anti-metastáticos e a análise intravital de uma cascata dinâmica e complexa de eventos.
Introduction
Metástase é a principal causa de morte de paciente com câncer1,2,3. As células cancerígenas metastáticas utilizam caminhos de sinalização distintos, dependentes do tipo de câncer, ao longo das cinco etapas da cascata metastática: invasão local, intravasão, sobrevivência na circulação, extravasão e expansão de colônias em locais metastáticos distantes. A compreensão atual desse processo metastático sugere que há duas etapas de gargalo, uma é a invasão direcional da célula cancerígena do tumor primário, e a segunda é o estabelecimento da lesão metastática do local distante4,5,6. Ambas as etapas exigem que as células cancerígenas interajam ativamente com colágeno e vasculatura nos locais de invasão inicial ou formação de lesão metastática distante. Portanto, as células cancerígenas metastáticas devem ser capazes de se conectar às células, remodelar as fibras de colágeno e invadir direcionalmente ao longo das paredes vasculares7. Modelos de rastreamento que podem identificar rapidamente alvos terapêuticos antimetastáticos para impedir que as células cancerígenas preeniram essas etapas é de maior importância. Os modelos de triagem in vitro existentes não imitam totalmente o complexo ambiente de tecido vivo. Os modelos de mouse são caros e demorados. Portanto, há uma necessidade urgente de plataformas de triagem intravital que forneçam ambientes complexos de tecido vivo e identificação rápida de alvos.
Na última década, o embrião de frango foi estabelecido como um modelo robusto e econômico de metástase do câncer humano8,9,10,11,12. O tecido da membrana corioallantóica do pintinho (CAM) é fino e translúcido, o que o torna ideal para imagens microscópicas intravitais de comportamentos celulares e colônias em tumores primários e/ou locais metastáticos12. O crescimento do tumor primário a partir de múltiplas linhas de células cancerígenas humanas pode ser iniciado e metástase dentro de um período de apenas vários dias após a microinjeção no tecido CAM. As células cancerígenas podem ser administradas no tecido CAM de várias maneiras, incluindo intravenosa, intra-CAM ou como onplants de colágeno, essa flexibilidade permite ao pesquisador focar em estágios específicos de progressão do câncer, por exemplo, formação de lesão metastática, invasão do tumor primário ou angiogênese.
Aqui descrevemos uma plataforma de triagem quantitativa que pode ser usada para medir a capacidade das células cancerosas de estabelecer lesões metastáticas invasivas. Células cancerígenas que foram transduzidas com uma biblioteca de expressão são injetadas intravenosamente na vasculatura CAM em baixa densidade. Colônias metastáticas se formam por 4-5 dias, então a capacidade de invasão e interação vasculatura das colônias resultantes é avaliada. Colônias individuais que não invadem são extirpadas, propagadas e seu fenótipo é confirmado na CAM por reinjeção e quantificação da compactação colônia e contatos de células cancerígenas-vasos sanguíneos. As construções da biblioteca de expressão responsáveis pelo fenótipo mutante da colônia metastática são identificadas a partir de DNA genômico de colônias isoladas através de sequenciamento de alto rendimento. A mesma plataforma pode ser usada para validar o nexo causal entre um gene e o fenótipo observado ou para realizar estudos mecanicistas aprofundados sobre o fenótipo observado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um protocolo de triagem intravital baseado em microscopia de fluorescência rápida que pode ser utilizado para aplicações importantes, como telas genéticas ou candidatas a medicamentos. Células cancerígenas que foram transduzidas com uma biblioteca genética de interesse ou transfeinadas com construtos de expressão individual podem ser rapidamente rastreadas e quantificadas quanto ao fenótipo de interesse usando este modelo CAM pintinho. Uma vez que os protocolos de transdução ou transfecção …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 à JDL e KS. Dr. Lewis ocupa a Cadeira Frank e Carla Sojonky em Pesquisa de Câncer de Próstata apoiada pela Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
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