Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel
Summary
Dit is een effectieve methode om te screenen op suppressors of drivers van kankermetastase. Cellen, getransduceerd met een expressiebibliotheek, worden geïnjecteerd in het kippen chorioallantoïsche membraan vasculatuur om gemetastaseerde kolonies te vormen. Kolonies met verminderde of verhoogde invasiviteit worden verwijderd, uitgebreid, opnieuw geïnjecteerd om hun fenotype te bevestigen en ten slotte geanalyseerd met behulp van sequencing met hoge doorvoer.
Abstract
Recente vooruitgang in kankeronderzoek heeft de zeer complexe aard van kankermetastasen aangetoond. Meerdere genen of genennetwerken bleken betrokken te zijn bij het differentieel reguleren van kankermetastaseerde cascadegenen en genproducten die afhankelijk zijn van het kankertype, weefsel en individuele patiëntkenmerken. Deze vertegenwoordigen potentieel belangrijke doelen voor genetische therapieën en gepersonaliseerde geneeskunde benaderingen. De ontwikkeling van platforms voor snelle screening is essentieel voor de identificatie van deze genetische doelen.
Het kuiken chorioallantoic membraan (CAM) is een sterk gevasculariseerd, collageenrijk membraan onder de eierschaal dat gasuitwisseling in het zich ontwikkelende embryo mogelijk maakt. Vanwege de locatie en vascularisatie van de CAM, ontwikkelden we het als een intravitaal metastasemodel voor menselijke kankercellen dat robuuste menselijke kankercel xenografting en real-time beeldvorming van kankercelinteracties met de collageenrijke matrix en vasculatuur mogelijk maakt.
Met behulp van dit model is een kwantitatief screeningsplatform ontworpen voor de identificatie van nieuwe drivers of suppressors van kankermetastasen. We transduceerden een pool van hoofd-hals HEp3 kankercellen met een complete menselijke genoom shRNA genbibliotheek, en injecteerden de cellen vervolgens, met lage dichtheid, in de CAM vasculatuur. De cellen verspreidden zich en vormden eencellige celkolonies. Individuele kolonies die niet in staat waren om binnen te dringen in het CAM-weefsel waren zichtbaar als een compact koloniefenotype en verwijderd voor identificatie van het transduceerde shRNA dat in de cellen aanwezig was. Beelden van individuele kolonies werden beoordeeld op hun invasiviteit. Meerdere selectierondes werden uitgevoerd om het aantal valse positieven te verlagen. Individuele, geïsoleerde kankercelklonen of nieuw ontwikkelde klonen die genen van belang uitdrukken, werden onderworpen aan primaire tumorvormingstest of kankercel vasculatuur co-optie analyse. Samenvattend presenteren we een platform voor snelle screening dat antimetastatische doelidentificatie en intravitale analyse van een dynamische en complexe cascade van gebeurtenissen mogelijk maakt.
Introduction
Metastase is de belangrijkste oorzaak van de dood van kankerpatiënten1,2,3. Gemetastaseerde kankercellen maken gebruik van verschillende signaleringsroutes, afhankelijk van het type kanker, gedurende de vijf stappen van de gemetastaseerde cascade: lokale invasie, intravasatie, overleving in de bloedsomloop, extravasatie en kolonieuitbreiding op verre gemetastaseerde locaties. Huidig begrip van dit gemetastaseerde proces suggereert dat er twee knelpuntstappen zijn, de ene is directionele invasie van de kankercel van de primaire tumor, en de tweede is de oprichting van de verre plaats gemetastaseerde laesie4,5,6. Beide stappen vereisen dat kankercellen actief interageren met collageen en vasculatuur op de plaatsen van initiële invasie of verre gemetastaseerde laesievorming. Daarom moeten gemetastaseerde kankercellen zich aan cellen kunnen hechten, collageenvezels kunnen remodelleren en directioneel langs vaatwanden kunnen binnendringen7. Screeningsmodellen die snel antimetastatic therapeutische doelen kunnen identificeren om kankercellen te blokkeren van het voltooien van deze stappen is van het grootste belang. Bestaande in vitro screeningmodellen bootsen de complexe levende weefselomgeving niet volledig na. Muismodellen zijn duur en tijdrovend. Daarom is er dringend behoefte aan intravital screeningplatforms die complexe leefweefselomgevingen en snelle identificatie van doelen bieden.
In het afgelopen decennium is het kippenembryo vastgesteld als een robuust en kosteneffectief model van menselijke kankermetastasen8,9,10,11,12. Het kuiken chorioallantoic membraan (CAM) weefsel is dun en doorschijnend waardoor het ideaal is voor intravitale microscopische beeldvorming van cel- en koloniegedrag in primaire tumor- en/of gemetastaseerde plaatsen12. Primaire tumorgroei uit meerdere menselijke kankercellijnen kan worden gestart en uitgezaaid binnen een periode van slechts enkele dagen na micro-inititie in het CAM-weefsel. Kankercellen kunnen op verschillende manieren in het CAM-weefsel worden toegediend, waaronder intraveneus, intra-CAM of als collageen op planten, deze flexibiliteit stelt de onderzoeker in staat om zich te concentreren op specifieke stadia van kankerprogressie, bijvoorbeeld gemetastaseerde laesievorming, invasie uit de primaire tumor of angiogenese.
Hier beschrijven we een kwantitatief screeningsplatform dat kan worden gebruikt om het vermogen van kankercellen te meten om invasieve gemetastaseerde laesies vast te stellen. Kankercellen die zijn getransduceerd met een expressiebibliotheek worden intraveneus geïnjecteerd in de CAM-vasculatuur met een lage dichtheid. Gemetastaseerde kolonies vormen zich gedurende 4-5 dagen, waarna de invasiecapaciteit en vasculatuurinteractie van de resulterende kolonies wordt geëvalueerd. Individuele kolonies die niet binnenvallen worden verwijderd, vermeerderd en hun fenotype wordt bevestigd in het CAM door herintroductie en kwantificering van kolonieverdichting en kankercel-bloedvatcontacten. De expressiebibliotheekconstructies die verantwoordelijk zijn voor het mutante fenotype van de enkele gemetastaseerde kolonie worden geïdentificeerd aan de deleis van geïsoleerd colony genomisch DNA via sequencing met hoge doorvoer. Hetzelfde platform kan verder worden gebruikt om het oorzakelijk verband tussen een gen en het waargenomen fenotype te valideren of om diepgaande mechanistische studies uit te voeren naar het waargenomen fenotype.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een snel fluorescentiemicroscopie gebaseerd intravital screening protocol dat kan worden gebruikt voor belangrijke toepassingen zoals genetische of drug kandidaat schermen. Kankercellen die zijn getransduceerd met een genetische bibliotheek van belang of getransfecteerd met individuele expressieconstructies kunnen snel worden gescreend en gekwantificeerd met behulp van dit chick CAM-model. Aangezien transductie- of transfectieprotocollen aanzienlijk variëren, afhankelijk van het type bibliotheek, zij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 aan JDL en KS. Dr. Lewis bekleedt de Frank en Carla Sojonky Chair in Prostate Cancer Research, ondersteund door de Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van’t Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D., Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. . The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. , 27-37 (2016).
