En musemodell for kronisk pankreatitt via gallekanal TNBS-infusjon

Summary

Kronisk pankreatitt (CP) er en sykdom preget av betennelse og fibrose i bukspyttkjertelen, ofte forbundet med intractable magesmerter. Denne artikkelen fokuserer på å raffinere teknikken for å generere en musemodell av CP via gallekanalinfusjon med 2,4,6 -trinitrobenzensulfonsyre (TNBS).

Abstract

Kronisk pankreatitt (CP) er en kompleks sykdom som involverer bukspyttkjertelbetennelse og fibrose, kjertelatrofi, magesmerter og andre symptomer. Flere gnagermodeller er utviklet for å studere CP, hvorav gallekanalen 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) infusjonsmodell replikerer egenskapene til nevropatisk smerte sett i CP. Imidlertid er gallekanalinfusjon hos mus teknisk utfordrende. Denne protokollen demonstrerer prosedyren for gallekanal TNBS-infusjon for generering av en CP-musemodell. TNBS ble infundert i bukspyttkjertelen gjennom ampulla av Vater i tolvfingertarmen. Denne protokollen optimalisert narkotika volum, kirurgiske teknikker, og narkotika håndtering under prosedyren. TNBS-behandlede mus viste egenskaper ved CP som reflektert av kroppsvekt og vektreduksjoner i bukspyttkjertelen, endringer i smerterelatert atferd og unormal morfologi i bukspyttkjertelen. Med disse forbedringene var dødeligheten forbundet med TNBS-injeksjon minimal. Denne prosedyren er ikke bare kritisk for å generere kreft i bukspyttkjertelen sykdom modeller, men er også nyttig i lokal bukspyttkjertel narkotika levering.

Introduction

Kronisk pankreatitt (CP) er en kronisk inflammatorisk sykdom preget av atrofi i bukspyttkjertelen, fibrose, magesmerter og eventuelt tap av både eksokrine og endokrine funksjoner¹. Nåværende medisinske og kirurgiske behandlinger er ikke kurative, men utføres for å lindre symptomer som er konsekvensen av sykdommen: ildfaste magesmerter, endokrine og eksokrine dysfunksjon. Derfor er det nødvendig med mer effektive behandlinger². Dyremodeller gir et viktig verktøy for å utvikle en bedre forståelse av sykdommen og undersøke potensielle terapeutiske^{stoffer 3}. Flere musemodeller for CP er utviklet, hvorav cerulein- og /eller alkoholmodeller ofte brukes. Cerulein, en oligopeptid stimulerende bukspyttkjertel sekresjon, har vist seg å reprodusere en CP-modell med pankreas atrofi, fibrose, blant andre⁴. En annen vanlig modell bruker serielle injeksjoner av L-arginin, som produserer eksokrininsuffisiens lik den som observeres hos humane pasienter⁵. CP kan også induseres ved fullstendig eller delvis ligasjon i bukspyttkjertelen, i tillegg til hypertensjon i bukspyttkjertelen^6,7. Til tross for mangfoldet av dyremodeller som er tilgjengelige for CP, reproduserer ingen av disse modellene effektivt magesmerter som oppleves av CP-pasienter⁸.

Tidligere studier viste at lokal pankreas injeksjon av 2,4,6 -trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS) gjenskaper vedvarende smerte opplevd av CP pasienter^9,10,11. TNBS-behandlede mus viste abdominal overfølsomhet og økt smerterelatert atferd samt en “generalisert overfølsomhet” for smertefulle stimuli, et fenomen som har blitt observert hos CP-pasienter¹⁰. I tillegg til nøyaktig etterligning av CP-smerte, replikerer TNBS-modellen også andre patologiske egenskaper ved den menneskelige tilstanden som fibrose, mononukleær celleinfiltrasjon og erstatning av acinarceller med fettvev^10,12. TNBS-infusjon via gallekanal er imidlertid en teknisk utfordrende prosedyre hos mus som kan forårsake død. Så vidt vi vet er det ingen visuell protokoll for å vise hvordan gallekanalinfusjon utføres. I denne artikkelen demonstrerer vi prosedyren for galleduksjonsinfusjonen av TNBS for å generere en CP-musemodell. Denne prosedyren vil bidra til å generere verdifulle dyremodeller for studiet av CP og andre bukspyttkjertelsykdommer og kan brukes til å tilføre andre materialer (f.eks. virus, celler) i bukspyttkjertelen¹³.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført med godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committees ved Medical University of South Carolina og Ralph H. Johnson Medical Center. C57BL/6J hannmus mellom 8-10 uker ble brukt i denne studien. Mus ble plassert under en standard 12 lys / 12 mørk syklus med ad libitumaccess til mat og vann. 1. Fremstilling av TNBS injeksjonsvæske, oppløsning Forbered 10% etanol i 0,9% saltvann. Løs opp lager TNBS (se Materialtabell) i 10 % etan…

Representative Results

Gallekanalen infusjonsprosedyrene ble optimalisert for å redusere musedødelighet forbundet med denne prosedyren10. TNBS ble først gitt i et totalt volum på 35 μL eller 50 μL. Injeksjon av TNBS i et volum på 50 μL kan nå hele bukspyttkjertelen og indusere en mer homogen sykdom fenotype (Figur 1B). I tillegg kan injeksjon av TNBS ved hjelp av insulinsprøyte med 31G-nål bedre kontrollere infusjonshastigheten i forhold til vanlige sprøyter og nålestørrelser….

Discussion

Gallekanalinfusjon av TNBS for å indusere kronisk pankreatitt er teknisk utfordrende hos mus, da opptil 22,5% av musene kan dø innen 3-4 dager etter legemiddelinfusjon¹⁰. Her raffinerte denne rapporten prosedyren basert på tidligere studier og reduserte tidlig musedødelighet til <10%. For eksempel kan det økte legemiddelvolumet (fra 35 μL til 50μL) sikre at stoffene når hele bukspyttkjertelen. Bruk av en insulinsprøyte og en mindre nålstørrelse (31G) reduserer potensiell skade på buksp…

Materials

10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF