Hi-C dans le noyau dans les cellules de la drosophile
Summary
Le génome est organisé dans l’espace nucléaire en différentes structures qui peuvent être révélées par les technologies de capture de conformation chromosomique. La méthode Hi-C dans le noyau fournit une collection à l’échelle du génome d’interactions de la chromatine dans les lignées cellulaires de la drosophile, qui génère des cartes de contact qui peuvent être explorées à la résolution de la mégabase au niveau du fragment de restriction.
Abstract
Le génome est organisé en domaines topologiquement associants (TAD) délimités par des limites qui isolent les interactions entre les domaines. Chez la drosophile, les mécanismes sous-jacents à la formation et aux limites du TAD sont encore à l’étude. L’application de la méthode Hi-C dans le noyau décrite ici a permis de disséquer la fonction des sites architecturaux de liaison aux protéines (AP) aux limites TAD isolant le gène Notch. La modification génétique des limites de domaine qui cause la perte de points d’accès entraîne la fusion tad, des défauts transcriptionnels et des altérations topologiques à longue portée. Ces résultats ont fourni des preuves démontrant la contribution des éléments génétiques à la formation des limites du domaine et au contrôle de l’expression génique chez la drosophile. Ici, la méthode Hi-C dans le noyau a été décrite en détail, ce qui fournit des points de contrôle importants pour évaluer la qualité de l’expérience avec le protocole. Sont également indiqués le nombre requis de lectures de séquençage et de paires Hi-C valides pour analyser les interactions génomiques à différentes échelles génomiques. L’édition génétique des éléments régulateurs médiée par CRISPR/Cas9 et le profilage à haute résolution des interactions génomiques à l’aide de ce protocole Hi-C dans le noyau pourraient être une combinaison puissante pour l’étude de la fonction structurelle des éléments génétiques.
Introduction
Chez les eucaryotes, le génome est divisé en chromosomes qui occupent des territoires spécifiques dans l’espace nucléaire pendant l’interphase1. La chromatine formant les chromosomes peut être divisée en deux états principaux: l’un de chromatine accessible qui est transcriptionnellement permissive, et l’autre de chromatine compacte qui est transcriptionnellement répressive. Ces états de chromatine se séparent et se mélangent rarement dans l’espace nucléaire, formant deux compartiments distincts dans le noyau2. À l’échelle des sous-mégabases, les limites séparent les domaines des interactions de la chromatine à haute fréquence, appelés TAM, qui marquent l’organisation chromosomique3,4,5. Chez les mammifères, les limites TAD sont occupées par la cohésine et le facteur de liaison CCCTC (CTCF)6,7,8. Le complexe de cohésine extrude la chromatine et s’arrête aux sites de liaison CTCF qui sont disposés dans une orientation convergente dans la séquence génomique pour former des boucles de chromatine stables9,10,13,14. La perturbation génétique du site de liaison à l’ADN CTCF aux limites ou la réduction de l’abondance des protéines CTCF et cohésine entraîne des interactions anormales entre les éléments régulateurs, une perte de formation de TAD et une dérégulation de l’expressiongénique 9,10,11,13,14.
Chez la drosophile, les limites entre les TAD sont occupées par plusieurs AP, y compris le facteur 32 kDa associé aux éléments limites (BEAF-32), la protéine de liaison motif 1 (M1BP), la protéine centrosomale 190 (CP190), le suppresseur d’aile velue (SuHW) et le CTCF, et sont enrichis en modifications actives des histones et en polymérase II16,17,18. Il a été suggéré que chez la drosophile, les TAD apparaissent à la suite de la transcription13 , 17,19, et le rôle exact des PO indépendants dans la formation des limites et les propriétés d’isolation est encore à l’étude. Ainsi, il reste à déterminer si les domaines de la drosophile sont la seule conséquence de l’agrégation de régions d’états transcriptionnels similaires ou si les AP, y compris le CTCF, contribuent à la formation des limites. L’exploration des contacts génomiques à haute résolution a été possible grâce au développement de technologies de capture de conformation chromosomique couplées à un séquençage de nouvelle génération. Le protocole Hi-C a été décrit pour la première fois avec l’étape de ligature effectuée « en solution »2 dans le but d’éviter les produits de ligature fallacieux entre les fragments de chromatine. Cependant, plusieurs études ont montré que le signal utile dans les données provenait de produits de ligature formés à des noyaux partiellement lysés qui n’étaient pas en solution20,21.
Le protocole a ensuite été modifié pour effectuer la ligature à l’intérieur du noyau dans le cadre de l’expérience Hi-C unicellulaire22. Le protocole Hi-C dans le noyau a ensuite été incorporé dans la population cellulaire Hi-C pour produire une couverture plus cohérente sur toute la gamme des distances génomiques et produire des données avec moins de bruit technique23,24. Le protocole, décrit en détail ici, est basé sur le protocole Hi-C de population dans le noyau23,24 et a été utilisé pour étudier les conséquences de l’élimination génétique des motifs de liaison à l’ADN pour CTCF et M1BP d’une limite de domaine au locus du gène Notch chez Drosophila25. Les résultats montrent que la modification des motifs de liaison à l’ADN pour les AP à la limite a des conséquences drastiques sur la formation du domaine Notch, des défauts topologiques plus importants dans les régions entourant le locus Notch et une dérégulation de l’expression génique. Cela indique que les éléments génétiques aux limites du domaine sont importants pour le maintien de la topologie du génome et de l’expression des gènes chez Drosophila25.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode Hi-C dans le noyau présentée ici a permis une exploration détaillée de la topologie du génome de la drosophile à haute résolution, fournissant une vue des interactions génomiques à différentes échelles génomiques, des boucles de chromatine entre les éléments régulateurs tels que les promoteurs et les amplificateurs aux TAM et à l’identification des grands compartiments25. La même technologie a également été appliquée efficacement aux tissus de mammifères avec qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme d’appui à l’innovation technologique et à la recherche de l’UNAM (PAPIIT) numéro de subvention IN207319 et le numéro de subvention du Conseil national de la science et de la technologie (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. est un étudiant à la maîtrise soutenu par le Conseil national des sciences et de la technologie (CONACyT) CVU numéro 968128.
Materials
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
- Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
- Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
- Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
- Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
- Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
- Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
- Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
- Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82 (2014).
- Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
- Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
- Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403 (2013).
- Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175 (2015).
- Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894 (2020).
- Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093 (2016).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310 (2015).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198 (2015).
- Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189 (2018).
- Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
- Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Ong, C. -. T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
- Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
- Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
- Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
- Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
- Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
- Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
- Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).
