Summary
Эмбрионы/личинки зебры развиваются внешне и оптически прозрачны. Биоаккумуляция микропластика у рыб на ранних стадиях жизни легко оценивается с помощью флуоресцентно помеченных микробусов.
Abstract
В качестве нового типа загрязнителей окружающей среды микропластик широко распространен в водной среде и представляет собой высокую угрозу для водных организмов. Биоаккумуляция микропластика играет ключевую роль в их токсических эффектах; однако, как частицы, их биоаккумуляции отличаются от многих других загрязнителей. Описанный здесь является возможным методом визуального определения накопления и распределения микропластика в эмбрионах зебры или личинках с использованием флуоресцентного микропластика. Эмбрионы подвергаются воздействию различных концентраций (0,1, 1 и 10 мг/л) флуоресцентного микропластика диаметром 500 нм на 120 ч. В результатах показано, что микропластик может биоаккумулятироваться в эмбрионах/личинках зебры в зависимости от концентрации. Перед вылуплением вокруг эмбрионального хориона обнаружена сильная флуоресценция; в то время как в личинках зебры, желточный мешок, перикард, и желудочно-кишечного тракта являются основными накопленными участками микропластика. Результаты демонстрируют поглощение и интернализации микропластика у зебры на ранних стадиях жизни, что обеспечит основу для лучшего понимания воздействия микропластика на водных животных.
Introduction
С момента первого синтеза в 1900-х годах, пластмассы широко используются в различных областях, что приводит к быстрому росту мирового производства1. В 2018 году в мире было произведено около 360 миллионов тоннпластмасс. Пластмассы в естественной среде будут деградировать до мелких частиц из-за химических, физических или биологическихпроцессов 3. Как правило, мелкие пластиковые частицы <5 мм в размерах определяются как микропластик4. Микропластик также разработан для конкретных применений, таких как микробусы из косметической продукции5. Как почти постоянные загрязняющие вещества, микропластик накапливается в окружающей среде, и привлекли все большее внимание со стороны ученых, политикови общественности 1,6. Предыдущие исследования документально, что микропластик может вызвать неблагоприятные последствия у рыб, таких как повреждениежелудочно-кишечного тракта 7,нейротоксичность 8, эндокринныенарушения 9,окислительный стресс 10 иповреждение ДНК 11. Тем не менее, токсичность микропластика до сих пор не полностью выявлена12,13.
Эмбрионы зебры предлагают множество экспериментальных преимуществ, включая небольшие размеры, внешнее оплодотворение, оптическую прозрачность и большие сцепления, и считается идеальной моделью организма для изучения воздействия загрязняющих веществ на рыбу на ранних стадиях жизни. Кроме того, для оценки биологических реакций требуется лишь ограниченное количество испытательных веществ. Здесь эмбрионы зебры подвергаются воздействию различных концентраций микропластика (0,1, 1, 10 мг/л) в течение 5 дней, а также оцениваются биоаккумуляция и распределение микропластика в эмбрионах/личинках зебры. Этот результат будет способствовать нашему пониманию токсичности микропластика для рыб, и метод, описанный здесь потенциально может быть обобщен для определения накопления и распределения других видов флуоресцентных материалов на ранних стадиях жизни зебры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Взрослые зебры происходят из Китайского ресурсного центра зебрафиш (Ухань, Китай). Эксперименты проводились в соответствии с национальным руководством "Руководство по этическому обзору благосостояния животных (GB/T35892-2018).
1. Коллекция эмбрионов
- Поддерживайте рыбу в стеклянных резервуарах 20 л с ревергентной системой водопроводной воды с углем (рН 7,0 ± 0,2) при постоянной температуре (28 ± 0,5 градуса по Цельсию) на фотопериоде света 14:10 ч: темно.
- Кормите рыбу два раза в день с Артемием nauplii. Рекомендуется, чтобы пища дается на максимум 3% массы рыбы в день и должны быть съедены в течение 5 минут каждый раз14.
- Передача хорошо развитых взрослых зебры (с длиной тела 3-4 см) в нерестовой бак в соотношении одного самца к двум самкам в ночь перед размножением.
ПРИМЕЧАНИЕ: На следующее утро рыба начинает появляться после начала светового цикла. - Собирайте яйца с помощью пипетки Pasteur. Промыть 10% раствором Хэнка несколько раз, а затем проверить на оплодотворение с помощью микроскопа. Оплодотворенные яйцеклетки проходят период расщепления примерно через 2 ч после оплодотворения (hpf) и могут быть четко определены15.
- Инкубировать оплодотворенные эмбрионы в стакане 500 мл, содержащем 200 мл раствора 10% Хэнка с 1% метиленовым синим для дезинфекции при 28 градусах Цельсия. Не превышать скорость загрузки 1 эмбриона/2 мл раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10% решение Хэнка состоит из 137 мМм NaCl, 5,4 мм ККл, 0,25 мм На2HPO4, 0,44 мМХ2PO4, 1,3 мМ CaCl2, 1,0 мММ MgSO4 и 4,2 мММ NaHCO3.
2. Подготовка микропластиковых суспензий
- Sonicate фондовый раствор зеленого флуоресцентно помечены полистироловые бусы (10 мг/мл) с номинальным диаметром 500 нм (возбуждение / выброс: 460/500 нм) в течение 10 минут.
- Разбавить фондовый раствор 10% раствором Хэнка для получения желаемых растворов экспозиции (0,1, 1 и 10 мг/л).
- Всегда подготовьте решения воздействия микропластика перед экспозицией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять осторожность при оценке токсического воздействия микропластика, потому что наличие консервантов, таких как азид натрия, в коммерческих формулировках частиц, может быть токсичным для различных организмов 16. Таким образом, эти добавки должны быть удалены или учтены в контроле перед проведением эксперимента токсичности.
3. Микропластиковая экспозиция
- Случайным образом выберите 6 недавно оплодотворенных эмбрионов (4 л.с.), а затем перенесите в каждую колодец 6-хорошо пластины, содержащей 5 мл микропластиковых растворов с различными концентрациями. Включите контрольные группы, содержащие 10% решения Хэнка.
- Используйте тройной скважины (в общей сложности 18 эмбрионов) для каждого лечения.
- Инкубировать эмбрионы под тем же светом: темный цикл и температуру, как взрослые (см. 1,2) и наблюдать каждые 12 часов. Немедленно удалите мертвых.
- Обновляем микропластиковые растворы 90% каждые 24 ч. В период воздействия рыбу не кормят.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, вылупление эмбриона начинается с 48 л.с. и завершается примерно на 72 л.с.
4. Оценка распределения микропластика
- В 24, 48, 72, 96 и 120 ч после оплодотворения, случайным образом выбрать эмбрионы / личинки (по одному из трех репликаций) и промыть с 10% раствор Хэнка.
- Перенесите личинки в чашку Петри и подвергайте 0,016% трикаин для анестезии.
- Приготовьте бульонный раствор трикаина: 4 мг трикайна растворяется в 100 мл двойной дистиллированной воды и отрегулируйте рН до 7,0 с Tris-HCl (рН 9.0). Храните раствор бульона в морозильной камере.
- Подготовь рабочее решение. Разбавить фондовый раствор до нужной концентрации (0.016%) с 10% раствором Хэнка при комнатной температуре14.
- Упорядочить эмбрионы / личинки и подготовиться к наблюдению.
- Наблюдайте за рыбой с помощью флуоресцентного микроскопа и изображения с помощью программного обеспечения для визуализации.
- Количественная оценка интенсивности флуоресценции у рыб с ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Распределение и накопление флуоресцентного микропластика показано на рисунке 1 и таблице 1. В неэкспонированных группах (контроль) не наблюдается видимой флуоресценции. Тем не менее, накопление флуоресценции находится вокруг хориона после воздействия различных концентраций микропластика (24 л.с.). Зеленая флуоресценция также обнаруживается у личинок, и уровень флуоресценции, как представляется, увеличивается в концентрации и времени зависит образом. Мешок желтка, перикард и желудочно-кишечный тракт являются основными накопленными участками микропластика(рисунок 2).
Рисунок 1: Распределение флуоресцентного микропластика полистирола в эмбрионах/личинках зебры (40×). Рыба пробы из контрольной группы, или группы подвергаются 500-нм микропластика на 0,1, 1 и 10 мг / л. Шкала бар 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Места накопления микропластика в личинках зебры (40×). Эта личинка пробы из группы подвергаются 500-нм микропластика на 10 мг / л в течение 120 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| концентрация | эмбрион | личинка | ||||
| (мг/л) | 24 л.с. | 48 л.с. | 48 л.с. б | 72 л.с. | 96 л.с. | 120 л.с. |
| Продолжение. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7,5±0,5 | 8,7±0,5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25,7±2,7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82,3±5,3 | 30.4 | 32,7±3,2 | 41,6±0,4 | 44.1±0.9 |
| a:оценивались только два эмбриона; b: была оценена только одна личинка. | ||||||
Таблица 1: Изменение уровня флуоресценции у зебры после воздействия флуоресцентного микропластика (n'3). Из-за влияния хориона на усвоение флуоресцентного микропластика данные делятся на две части: эмбрионы (до вылупления) и личинки (после вылупления).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В соответствии с руководящим принципом по защите животных, используемых в научных целях, таких как Директива ЕС 2010/63/EU, разрешение на этику животных не является обязательным для эксперимента с ранними стадиями жизни зебры до стадии быть способным к самостоятельному кормлению (5 дней после оплодотворения)17. Однако для оптимизации использования зебры важна передовая практика обеспечения благосостояния, и, например, следует обратить озабоченность гуманными методами анестезии и эвтаназии. Этил 3-аминобензоат метансульфат (MS-222, или трикаин), регулярно используемый агент в большинстве лабораторий, используется здесь для анестезии и эвтаназии.
Перед наблюдением под микроскопом эмбрионы и личинки следует промыть, так как микропластик, адсорбирован на внешней поверхности, может помешать результатам. Кроме того, аутофторесценция эмбрионов/личинок, особенно вокруг желточного мешка, о котором иногда сообщается, может быть проблематичной. Присутствие многих биомакромолекул, таких как флавины, никотинамид-аденин динуклеотид (NAD), ароматические аминокислоты, липофусцины, передовые продукты гликации конца, и коллаж, будет излучать свет, когда возбужденных на соответствующей длине волны.
Важно отметить, что, как загрязнитель твердых частиц, размер микропластика считается одним из определяющих факторов биодоступности итоксичности 18. Номинальный диаметр используемого здесь микропластика составляет 500 нм, что сравнительно с размером поры хориона эмбриона (в пределах от 300 нм до1 мкм) 19. Таким образом, эти микропластика, как ожидается, не легко пройти через зебрафиш хорион. Последовательно, есть мало флуоресценции видны в эмбрионах до вылупления (Рисунок 1). Так как хорион будет выступать в качестве эффективного барьера против частиц с большими размерами, процесс дехорионации до воздействия может потребоваться. Хорион можно легко удалить с помощью типсов, но энзиматическая дехорионация проназой предпочтительнее, когда эмбрионы обрабатываются оптом. Однако, хотя дехорионизация повысит биодоступность и облегчит скрининг на токсичность веществ с высокой пропускной способностью, эмбрион с хорионом более рекомендуется оценивать экотоксичность загрязняющих веществ при рассмотрении состояния воздействия в "реальном" мире.
Хотя значительные усилия были направлены на изучение неблагоприятного воздействия микропластика на рыбу, нынешние знания, в том числе биоаккумуляции, остаются ограниченными или даже противоречивыми. Эти несоответствия в исследованиях объясняются главным образом различиями свойств частиц, включая размер, плотность и поверхностные характеристики (например, поверхностный заряд). Поведение микропластика в растворе имеет решающее значение для биодоступности, а также. Физикохимические характеристики микропластика должны отслеживаться в течение продолжительности экспозиции, и явление агрегации, которое может произойти, должно быть зарегистрировано. В самом деле, для воздействия, которые требуют микропластика, которые будут приостановлены в течение длительного периода, sonication или перемешивания с магнитным баром рекомендуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляет об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (21777145, 22076170) и Программой для ученых Чанцзяна и Группой инновационных исследований в Университете (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L.
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R.
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
