Denne fraktioneringsprotokol giver forskere mulighed for at isolere cytoplasmatiske, nukleare, mitokondrie- og membranproteiner fra pattedyrceller. De to sidstnævnte subcellulære fraktioner renses yderligere via isopycnic densitetsgradient.
Denne protokol beskriver en metode til opnåelse af subcellulære proteinfraktioner fra pattedyrceller ved hjælp af en kombination af vaskemidler, mekanisk lysis og isopycnic densitetsgradientcentrifugering. Den største fordel ved denne procedure er, at den ikke er afhængig af den eneste anvendelse af opløselige vaskemidler for at opnå subcellulære fraktioner. Dette gør det muligt at adskille plasmamembranen fra andre membranbundne organeller i cellen. Denne procedure vil lette bestemmelsen af proteinlokalisering i celler med en reproducerbar, skalerbar og selektiv metode. Denne metode er med succes blevet anvendt til at isolere cytosoliliske, nukleare, mitokondrielle og plasmamembranproteiner fra den humane monocytcellelinje, U937. Selvom den er optimeret til denne cellelinje, kan denne procedure tjene som et passende udgangspunkt for den subcellulære fraktionering af andre cellelinjer. Potentielle faldgruber i proceduren, og hvordan man undgår dem, diskuteres, ligesom ændringer, der muligvis skal overvejes for andre cellelinjer.
Subcellulær fraktionering er en procedure, hvor celler lyseres og adskilles i deres bestanddele gennem flere metoder. Denne teknik kan bruges af forskere til at bestemme proteinlokalisering i pattedyrceller eller til berigelse af proteiner med lav forekomst, som ellers ikke ville kunne detekteres. Mens der i øjeblikket findes metoder til subcellulær fraktionering, ligesom kommercielle kits, der kan købes, lider de af flere begrænsninger, som denne procedure forsøger at overvinde. De fleste cellefraktioneringsmetoder er udelukkende vaskemiddelbaserede1,2, der er afhængige af brugen af buffere, der indeholder stigende mængder vaskemiddel til at opløse forskellige cellulære komponenter. Selvom denne metode er hurtig og praktisk, resulterer den i urene fraktioner. Disse er designet til at give forskere mulighed for let at isolere en eller to komponenter i cellen, men er ikke komplekse nok til at isolere flere subcellulære fraktioner fra en prøve på samme tid. At stole udelukkende på vaskemidler resulterer normalt i membranlukkede organeller, og plasmamembranen opløses vilkårligt, hvilket gør adskillelse af disse komponenter vanskelig. En yderligere komplikation fra brugen af disse kits er forskernes manglende evne til at ændre / optimere dem til specifikke applikationer, da de fleste af komponenterne er proprietære formuleringer. Endelig kan disse sæt være uoverkommeligt dyre med begrænsninger i antallet af anvendelser, der gør dem mindre end ideelle til større prøver.
På trods af tilgængeligheden af sæt til isolering af mitokondrier, der ikke er afhængige af vaskemidler, er de ikke designet til at isolere plasmamembranen og give betydeligt lavere mængder prøve end standardisoleringsprotokoller 3,4. Mens differentielle centrifugeringsmetoder er mere tidskrævende, resulterer de ofte i forskellige fraktioner, der ikke kan opnås med udelukkende vaskemiddelbaserede sæt1. Separation uden udelukkende brug af opløselige vaskemidler tillader også yderligere rensning ved hjælp af ultracentrifugering og isopycniske densitetsgradienter, hvilket resulterer i mindre krydskontaminering. Denne fraktioneringsprotokol demonstrerer isolering af subcellulære fraktioner fra U937-monocytter ved hjælp af en kombination af vaskemiddel- og højhastighedscentrifugeringsbaserede tilgange. Denne metode vil lette isoleringen af de nukleare, cytoplasmatiske, mitokondrielle og plasmamembrankomponenter i en pattedyrcelle med minimal forurening mellem fraktionerne.
Denne metode er en modificeret version af en tidligere offentliggjort tilgang til subcellulær fraktionering uden brug af højhastighedscentrifugering11. Denne modificerede metode kræver mere specialiseret udstyr for at opnå de bedste resultater, men er mere omfattende og konsekvent reproducerbar.
Udviklingen af den oprindelige protokol var nødvendig på grund af manglende evne til at adskille mitokondrie- og membranprøver til analyse af proteinlokalisering under ne…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH R15-HL135675-01 og NIH 2 R15-HL135675-02 til T.J.L.
Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
digitonin | Sigma | D141 | |
end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
HEPES | VWR | 97064-360 | |
Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
KCl | Sigma | P9333 | |
Mannitol | Sigma | M9647 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
sonicator | ThermoFisher | ||
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |