Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

Summary

Dieses Fraktionierungsprotokoll wird es Forschern ermöglichen, zytoplasmatische, nukleare, mitochondriale und Membranproteine aus Säugetierzellen zu isolieren. Die beiden letztgenannten subzellulären Fraktionen werden über einen isopyknischen Dichtegradienten weiter gereinigt.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Gewinnung subzellulärer Proteinfraktionen aus Säugetierzellen unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien, mechanischer Lyse und isopyknischer Dichtegradientenzentrifugation. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nicht auf die alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien angewiesen ist, um subzelluläre Fraktionen zu erhalten. Dadurch ist es möglich, die Plasmamembran von anderen membrangebundenen Organellen der Zelle zu trennen. Dieses Verfahren wird die Bestimmung der Proteinlokalisation in Zellen mit einer reproduzierbaren, skalierbaren und selektiven Methode erleichtern. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um zytosolische, nukleare, mitochondriale und Plasmamembranproteine aus der menschlichen Monozytenzelllinie U937 zu isolieren. Obwohl für diese Zelllinie optimiert, kann dieses Verfahren als geeigneter Ausgangspunkt für die subzelluläre Fraktionierung anderer Zelllinien dienen. Mögliche Fallstricke des Verfahrens und wie diese vermieden werden können, werden ebenso diskutiert wie Veränderungen, die möglicherweise für andere Zelllinien berücksichtigt werden müssen.

Introduction

Subzelluläre Fraktionierung ist ein Verfahren, bei dem Zellen lysiert und durch verschiedene Methoden in ihre Bestandteile getrennt werden. Diese Technik kann von Forschern verwendet werden, um die Proteinlokalisierung in Säugetierzellen zu bestimmen oder Proteine mit geringer Abundanz anzureichern, die sonst nicht nachweisbar wären. Während es derzeit Methoden zur subzellulären Fraktionierung gibt, ebenso wie kommerzielle Kits, die erworben werden können, leiden sie unter mehreren Einschränkungen, die dieses Verfahren zu überwinden versucht. Die meisten Zellfraktionierungsmethoden basieren ausschließlich auf Detergenzien^1,2 und basieren auf der Verwendung von Puffern^, die zunehmende Mengen an Detergens enthalten, um verschiedene zelluläre Komponenten zu lösen. Während diese Methode schnell und bequem ist, führt sie zu unreinen Fraktionen. Diese sind so konzipiert, dass Forscher eine oder zwei Komponenten der Zelle leicht isolieren können, sind aber nicht komplex genug, um mehrere subzelluläre Fraktionen gleichzeitig aus einer Probe zu isolieren. Sich ausschließlich auf Reinigungsmittel zu verlassen, führt in der Regel dazu, dass membranumschlossene Organellen und die Plasmamembran wahllos gelöst werden, was die Trennung dieser Komponenten erschwert. Eine zusätzliche Komplikation durch die Verwendung dieser Kits ist die Unfähigkeit der Forscher, sie für bestimmte Anwendungen zu ändern / zu optimieren, da die meisten Komponenten proprietäre Formulierungen sind. Schließlich können diese Kits unerschwinglich teuer sein, mit Einschränkungen in der Anzahl der Anwendungen, die sie für größere Proben nicht ideal machen.

Trotz der Verfügbarkeit von Kits für die Isolierung von Mitochondrien, die nicht auf Detergenzien angewiesen sind, sind sie nicht für die Isolierung der Plasmamembran ausgelegt und liefern signifikant geringere Probenmengen als Standard-Isolierungsprotokolle ^3,4. Während differentielle Zentrifugationsmethoden zeitaufwendiger sind, führen sie oft zu unterschiedlichen Fraktionen, die mit ausschließlich waschmittelbasierten Kits nicht erhalten werden können¹. Die Trennung ohne alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien ermöglicht auch eine weitere Reinigung mittels Ultrazentrifugation und isopyknischen Dichtegradienten, was zu weniger Kreuzkontamination führt. Dieses Fraktionierungsprotokoll demonstriert die Isolierung subzellulärer Fraktionen aus U937-Monozyten unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien- und Hochgeschwindigkeitszentrifugationsansätzen. Diese Methode erleichtert die Isolierung der Kern-, Zytoplasma-, Mitochondrien- und Plasmamembrankomponenten einer Säugetierzelle mit minimaler Kontamination zwischen den Fraktionen.

Protocol

1. Puffer und Reagenzien vorbereiten Bereiten Sie frische Lösungen von Phosphatase- und Proteaseinhibitoren vor.17,4 mg Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) zu 1 ml 100% Ethanol hinzufügen, um eine 100 mM Brühe herzustellen.HINWEIS: Tragen Sie Schutzausrüstung beim Umgang mit PMSF, da diese bei Einnahme oder Einatmen und bei Kontakt mit Haut oder Augen gefährlich ist. Es ist ätzend für Augen und Haut. Bereiten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen handelsüblichen Proteas…

Representative Results

Ein schematisches Flussdiagramm dieses Verfahrens (Abbildung 1) fasst visuell die Schritte zusammen, die unternommen wurden, um U9375-Zellen erfolgreich zu fraktionieren, die in Suspension gezüchtet wurden. Fraktionen, die von der Oberseite des isopyknischen Dichtegradienten in gleichen Volumina (1 ml) gesammelt wurden, zeigen die Reinigung der mitochondrialen und Membranfraktionen (Abbildung 2). Die Verwendung eines Antikörpers gegen V…

Discussion

Dieses Verfahren ist eine modifizierte Version eines zuvor veröffentlichten Ansatzes zur subzellulären Fraktionierung ohne den Einsatz von Hochgeschwindigkeitszentrifugation¹¹. Diese modifizierte Methode erfordert mehr spezialisierte Ausrüstung, um die besten Ergebnisse zu erzielen, ist aber umfassender und konsistent reproduzierbar.

Die Entwicklung des ursprünglichen Protokolls war aufgrund der Unfähigkeit erforderlich, mitochondriale und Membranproben für die An…

Materials

Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661